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一、试述电子显微镜概况答题要点：1．透射电镜（TEM）透射电镜即透射电子显微镜（TransmissionElectronMicroscope，简称TEM），通常称作电子显微镜或电镜（EM），是使用最为广泛的一类电镜。它的主要特点是利用电子射线（或称电子束也称电子波）穿透样品，而后经多级电子放大后成像于荧光屏。它的主要优点是分辨率高，可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌，在生命科学领域中应用最为广泛。根据加速电压的大小，又可将TEM分为一般TEM（加速电压小于120KV）、高压TEM（加速电压在120KV～500KV之间）和超高压TEM（加速电压大于500KV）。1）一般TEM。最常用的是100KV电镜。这种电镜分辨率高（点0.3nm，晶格0.14nm），但穿透本领小，观察样品必须很薄，约为30～100nm，如细胞和组织的超薄切片、复型膜和负染样品等。这种电镜在生命科学领域中应用已相当普及。2）高压TEM。目前常用的是200KV电镜。这种电镜对样品的穿透本领约为100KV电镜的1.6倍，可以在观察较厚样品时获得很好的分辨本领，从而可以对细胞结构进行三维观察。3）超高压TEM。目前已有500KV、1000KV和3000KV的超高压TEM。这类电镜具有穿透本领强、辐射损伤小、可以配备环境样品室及进行各种动态观察等优点，分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。在超高压电镜上附加充气样品室，使人们可以观察活细胞内的超微结构动态变化。2．扫描电镜（SEM）扫描电镜即扫描电子显微镜（ScanningElectronMicroscope，简称SEM），其主要是利用电子射线轰击样品表面，引起二次电子等信号的发射，经检测装置接收后成像的一类电镜。其特点是景深长，所获得的图像立体感强，可用来观察生物样品的各种形貌特征。在生命科学研究中，采用不同的样品制备技术可观察不同的结构，如用临界点干燥法可观察样品的表面形貌；用冷冻割裂方法可观察样品割裂面的结构；用铸型方法可观察管腔内表面的结构等。1）一般SEM。目前一般扫描电镜采用热发射电子枪，分辨率为6nm左右，若采用六硼化镧电子枪，分辨率可提高到4～5nm。这种电镜在生命科学领域中的应用也已相当普及。2）场发射电子枪SEM。由于场发射电子枪具有亮度高、能量分散少，阴极源尺寸小等优点，这种电镜的分辨率已达到3nm。场发射电子枪SEM的另一个优点是可以在低加速电压下进行高分辨率观察，因此可以直接观察绝缘体而不发生充、放电现象。3）生物用SEM。这种SEM备有冰冻冷热样品台，可把含水生物样品迅速冷冻并对冰冻样品进行观察，可以减少化学处理引起的人为变化，使观察样品更接近于自然状态。如要观察内部结构，还可用冷刀把样品进行切开，加温使冰升华，并在其上喷镀一层金属再进行观察，所有这些过程都在SEM中不破坏真空的状态下进行。3．电子探针电子探针主要用于探测微小区域的元素成分。其原义仅是一个物理学名词，意指聚焦了的电子束。当电子束照射样品表面时，可激发X射线，X射线光量子的能量及波长与元素的原子序数有关，称为特征X射线。采用晶体分光光谱法测定X射线的波长和强度来分析样品成分的仪器，称为X射线分光光谱仪或电子探针；用锂漂移硅探头测定X射线能量和强度的仪器称为X射线能谱仪。4．分析电镜分析电镜是利用电子射线轰击样品所产生的X射线或俄歇电子对样品元素进行分析的一类电镜。其特点是能在观察超微结构的同时，对样品中一个极微小的区域进行化学分析，从而在超微结构水平上测定各种细胞结构的化学成分及其变化规律。1）分析TEM。在TEM上配备X射线能谱仪后即成为分析TEM，目前很多100KV和200KVTEM都可以装上X射线检测附件，进行样品的元素分析。2）分析SEM。在SEM上配备X射线能谱仪后，便可兼有电子探针分析样品化学成分的功能。3）扫描俄歇电镜。把SEM与俄歇电子能量分析仪相结合，即成为扫描俄歇电镜，它能对样品表面进行微区元素分析，是一种表面微观分析电镜。5．扫描透射电镜SEM中电子射线作用于样品后，其中一部分电子可透过样品成为透射电子，将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像，即成为扫描透射电镜。这种电镜一般用场发射电子枪，兼有TEM、SEM和分析电镜的特点，能观察较厚的样品，分辨本领和成像质量都很好，是近年来电镜技术的最大改进之一。二、试述常用电子显微术答题要点：（一）与TEM有关的电子显微术1．超薄切片技术。由于电子射线穿透本领很差，对厚于0.1μ的切片就很难透过。因此，必须把生物标本切得很薄才能在TEM下观察。超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤，将生物标本切成薄于0.1μ的超薄切片的样品制备技术，用于生物组织的内部超微结构研究。超薄切片技术是所有电镜生物样品制备技术中最常用、最基本的一种技术。2．负染色技术。利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨酸钠、醋酸铀等）将生物标本包围起来，增强背景散射电子的能力以提高反差，在黑暗的背景下显示标本的形态结构，称负染色技术。这一技术操作简便，主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。3．冷冻蚀刻技术。在快速冷冻下对生物样品进行断裂、蚀刻和复型，制备生物样品复型膜的技术称冷冻蚀刻技术。在电镜下观察复型膜可获得立体感强的超微结构图像，主要用于生物膜结构的研究。4．电镜细胞化学技术。在超微结构水平上，通过电镜细胞化学反应来研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。这一技术把细胞超微结构与其化学组成有机地结合起来，目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。5．免疫电镜技术。这是一种使抗原在超微结构水平上定位的技术，应用与抗原相应的标记抗体，在电镜下观察标记物的位置，从而定位相应抗原。这一技术具有灵敏度高、特异性强的特点。6．电镜放射自显影技术。这是电镜技术与放射自显影技术相结合，观察放射性物质在超微结构水平上的定位和变化，从而了解细胞的各种代谢活动。这一技术使结构与功能的研究结合起来，是一种动态的研究方法。（二）与SEM有关的电子显微术1．SEM常规制样技术。SEM适合于研究生物样品的表面特征，样品制备包括样品观察面的暴露、固定、干燥和导电等步骤，使表面特征充分暴露而不变形。这一技术是SEM样品制备的常规技术，主要用于组织、细胞、寄生虫等表面形貌的研究。2．生物标本割裂技术。将生物标本放在特殊包埋剂中经冷冻或其他方法固化，然后把固化的标本割裂，暴露组织和细胞的内部结构，再经干燥和导电后在SEM下观察。这一技术使SEM能观察生物标本的内部结构，目前最常用的是冷冻割裂技术。3．铸型技术。用铸型技术（如甲基丙烯酸酯和ABS等）注入生物体的腔性器官，制成铸型标本，可在SEM下观察管腔内表面的结构。目前最常用的是血管铸型技术，用以研究微小血管的分布和形貌。