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1.2基因工程的基本操作程序情境导入课程目标将苏云金芽孢杆菌(图一)的毒蛋白基因提取出来导入普通棉花(图二)细胞可培育成转基因抗虫棉(图三),从毒蛋白基因的提取到成功培育成抗虫棉,基本的操作程序是怎样的?每一操作环节的原理和技术是怎样的?1.简述基因工程原理和技术。2.用流程图表示基因工程的基本操作程序。3.用流程图表示目的基因的检测与鉴定程序。4.列表比较几种转化方法的异同和目的基因检测与鉴定的几个环节的异同。5.尝试设计某一转基因生物的研制过程。6.关注基因工程的发展。一二三四基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。一、目的基因的获取1.目的基因主要是指编码蛋白质的基因。2.获取目的基因的常用方法有以下几种:(1)从基因文库中获取目的基因。将含有某种生物不同基因的许多DNA片段导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因文库包括两种:基因组文库,即包含一种生物所有基因的文库;部分基因文库,即只包含一种生物一部分基因的文库,如cDNA文库。一二三四(2)利用PCR技术扩增目的基因。①PCR的含义:是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。②目的:获取大量的目的基因。③原理:DNA双链复制。④过程:第一步,加热至90~95℃,DNA解链;第二步,冷却到55~60℃,引物结合到互补DNA链;第三步,加热至70~75℃,Taq酶从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。⑤特点:指数形式扩增。(3)用化学方法人工合成。如果基因比较小,核苷酸序列又已知,也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。一二三四轻松判断PCR属于DNA片段的复制技术,操作时也存在使DNA解旋的环节。PCR的DNA解旋和体内DNA复制的解旋有何区别?提示:PCR的DNA解旋依靠高温处理,不需要解旋酶;而体内DNA复制的解旋依靠解旋酶的催化作用,是在常温下进行的。一二三四二、基因表达载体的构建1.构建目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的组成:目的基因、启动子、终止子、标记基因等。3.由于受体细胞不同,以及目的基因导入受体细胞的方法不同,基因表达载体的构建也有所差别。一二三四三、将目的基因导入受体细胞1.转化的概念:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法(1)将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法,除此之外,还有基因枪法和花粉管通道法等。(2)将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。(3)将目的基因导入微生物细胞:早期的基因工程都用原核生物作为受体细胞,其中以大肠杆菌应用最为广泛。大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:先用Ca2+处理细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程。一二三四四、目的基因的检测与鉴定1.首先,要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是采用DNA分子杂交技术。2.其次,还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采用标记的目的基因作探针与mRNA杂交,如果显示出杂交带,则表明目的基因转录出了mRNA。3.最后,检测目的基因是否翻译成蛋白质。方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已形成蛋白质产品。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。一二三四自主思考欲探究转基因抗虫植物最终是否培育成功,应如何设计实验?提示:种植同种的普通植物和抗虫植物,在相同培养条件下让某种害虫取食,观察害虫的生理状况。探究一探究二目的基因的获取和基因表达载体的构建●问题导引●基因疫苗指的是DNA疫苗,即将编码外源性抗原的基因插入含真核表达系统的质粒上,然后将质粒直接导入人或动物体内,让其在宿主细胞中表达抗原蛋白,诱导机体产生免疫应答。抗原基因在一定时限内的持续表达,不断刺激机体免疫系统,使之达到防病的目的。思考:(1)如何获得更多数量的编码外源性抗原的基因以用于基因工程?该过程必需的酶是什么?(2)含有目的基因和表达系统的质粒在基因工程中叫什么名称?该结构必需的组成部分包括哪些?提示:(1)通过PCR技术能获得更多数量的编码外源性抗原的基因。PCR必需的酶是热稳定DNA聚合酶即Taq酶。(2)含有目的基因和表达系统的质粒在基因工程中叫基因表达载体,基因表达载体必需的组成部分包括启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点等。易错点排查探究一探究二●名师精讲●1.DNA复制与PCR技术比较DNA复制PCR技术解旋方式解旋酶催化DNA在高温作用下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)在PCR扩增仪内酶DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等耐热的DNA聚合酶(Taq酶)温度条件细胞内温和条件需控制温度,在较高温度下进行合成的对象DNA分子DNA片段或基因易错点排查探究一探究二DNA复制PCR技术联系①模板:均需要脱氧核苷酸链作为模板进行物质合成②原料:均为四种脱氧核苷酸③酶:均需要DNA聚合酶进行催化④引物:均需要引物,使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸特别提醒①PCR技术不需要解旋酶,但需利用90~95℃高温使DNA分子解旋。②热稳定的DNA聚合酶能在高温中保持酶的活性,具有耐高温的特点,是PCR技术的关键工具之一。易错点排查探究一探究二●名师精讲●1.DNA复制与PCR技术比较2.从基因文库中获取和人工合成目的基因的比较方法从基因文库中获取人工合成从基因组文库中获取从通过反转录法形成的cDNA文库中获取化学合成法反转录法过程供体细胞中的DNA许多DNA片段载体受体菌群(基因组文库)↓外源DNA扩增,产生特定性状目的基因目的基因的mRNA单链DNA双链DNA载体受体菌群(cDNA文库)目的基因蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因目的基因的mRNA单链DNA双链DNA即目的基因易错点排查探究一探究二方法从基因文库中获取人工合成从基因组文库中获取从通过反转录法形成的cDNA文库中获取化学合成法反转录法优点操作简单专一性强专一性强,可产生自然界中不存在的新基因专一性强缺点工作量大,盲目性大,专一性差操作过程较复杂,技术要求过高适用范围小操作过程复杂,mRNA生存时间短,技术要求高易错点排查探究一探究二3.基因表达载体的组成(见右图)基因表达载体模式图易错点排查探究一探究二(1)目的基因:外源DNA分子的有效片段。(2)启动子:是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。(3)终止子:位于基因的尾端,也是一段有特殊结构的DNA短片段。终止子相当于一盏红色信号灯,使转录到此终止。(4)标记基因:作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。特别提醒①启动子与目的基因的表达有关,复制原点与表达载体的复制有关。②不同的组织细胞需要的启动子不同即启动子具有组织细胞特异性。易错点排查探究一探究二4.基因表达载体的功能(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。易错点排查探究一探究二5.基因表达载体的构建步骤(1)用同一种限制酶切割目的基因和质粒,使其产生相同末端。(2)将切下的目的基因片段与切开的质粒混合,再加入适量DNA连接酶,使目的基因插入质粒的切口处,形成一个重组DNA分子(重组质粒)。构建过程如下图所示。易错点排查探究一探究二特别提醒选择限制酶处理质粒和外源DNA时,应保证酶切位点不在目的基因内部和启动子、终止子、标记基因(至少一个)、复制原点内部,以避免基因表达载体必需的这些结构失去原有作用。易错点排查探究一探究二【例题1】请据图回答下列问题。(1)基因工程的核心步骤是。(2)利用技术可以获得大量的目的基因。该技术利用______的原理,将基因的核苷酸序列不断加以复制,使其数量呈指数增长。(3)图中a位于基因的首端,是识别和结合的部位。抗生素抗性基因的作用是作为,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因。易错点排查探究一探究二解析:基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。要得到大量的目的基因,可以通过PCR技术扩增,PCR技术的原理是DNA分子复制。该基因表达载体中a表示的是启动子,其中有与RNA聚合酶识别和结合的部位。抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞是否导入了目的基因。答案:(1)基因表达载体的构建(2)PCRDNA双链复制(3)启动子RNA聚合酶标记基因易错点排查探究一探究二典型方法识记基因表达载体的应有片段及各片段的作用是解答此类题型的关键。应依据基因表达载体的作用围绕目的基因按顺序识记基因表达载体应有的片段:基因表达载体的作用基因表达载体应有的片段目的基因的载体目的基因表达目的基因启动子(目的基因的首端)终止子(目的基因的尾端)使目的基因复制和传递复制原点检测目的基因是否进入受体细胞标记基因易错点排查探究一探究二变式训练1下列关于对基因表达载体构建的一些说法,不正确的是()A.需要限制酶和DNA连接酶参与B.基因表达载体中含有启动子和终止密码C.通常用抗生素抗性基因作为标记基因D.基因表达载体的构建是基因工程的核心解析:基因表达载体的构建关系到目的基因在受体细胞中能否表达,它是基因工程的核心,它的构建需要限制酶和DNA连接酶参与,它的结构应由目的基因、启动子、终止子、标记基因等组成,终止密码是指位于mRNA上的不编码蛋白质的三个相邻碱基,是翻译结束的位点,而终止子是位于DNA上三个相邻的碱基,它是转录结束的位点。答案:B易错点排查探究一探究二将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定●问题导引●运用基因工程技术,将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中,培育出转基因抗虫油菜。这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白,对菜青虫有显著抗性,能大大减轻菜青虫对油菜的危害,提高油菜产量,减少农药使用量,保护农业生态环境。思考:(1)将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜细胞并在其中维持稳定和表达的过程在基因工程中称为什么?列举将目的基因转移到植物细胞并在其中维持稳定和表达常用的方法。(2)转基因抗虫油菜是否培育成功需要检测该品种在生长过程中能否产生特异的杀虫蛋白,简述该过程常用的检测方法。易错点排查探究一探究二提示:(1)转化。植物基因工程常用的转化方法包括农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法等。(2)从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,若有杂交带出现,表明目的基因已形成蛋白质产品(例如杀虫蛋白)。易错点排查探究一探究二●名师精讲●1.目的基因导入受体细胞的方法细胞类型方法转化过程特点植物细胞农杆菌转化法目的基因插入到Ti质粒的TDNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入到植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达经济、有效,适用于双子叶植物和裸子植物基因枪法目的基因包裹在微小的金粒子或钨粒子表面→用基因枪高速射入受体细胞或组织中→目的基因表达成本较高,是单子叶植物中常用的转化方法花粉管通道法在植物受粉后,花粉形成的花粉管还未愈合前,剪去柱头,滴加目的基因,使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞简便、经济,我国科学家独创易错点排查探究一探究二细胞类型方法转化过程特点动物细胞显微注射法目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物最为有效的将目的基因导入动物细胞的方法微生物细胞Ca2+处理法Ca2+处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效易错点排查探究一探究二特别提醒①将目的基因导入植物细胞培育