搜索
第4章基因工程第1节基因工程的基本原理和技术1.理解限制性核酸内切酶(简称限制性内切酶或限制酶)的特点、作用。2.理解DNA连接酶的种类、作用,并知道常用工具酶的区别与联系。3.理解基因进入受体细胞的常用运载体、质粒的知识、运载体的作用与特点。1.基因工程的概念与原理基因工程的别名DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平分子水平操作手段及结果通过体外DNA重组和转基因等技术,定向地改变生物的遗传特性,创造出新型的生物2.基因工程研究的理论基础分子生物学的研究,主要有三大科学成就。(1)20世纪40年代证实DNA是主要遗传物质,它是遗传信息的携带者。(2)20世纪50年代确立了DNA的双螺旋构型,遵循碱基互补原则,DNA进行半保留复制。(3)20世纪60年代,提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。3.基因工程操作技术的突破(1)DNA分子的切割技术①基因工程的“分子手术刀”——限制性内切酶,主要存在于微生物中。②该酶的作用特点是能够识别DNA中某种核苷酸的序列和位置,并在这个位置切开DNA分子。③限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端。(2)DNA分子的连接技术“分子缝纫针”——连接酶的作用是将双链DNA片段连接起来。(3)DNA分子的运载工具运载体必须具备的条件:①必须是一种能够自我复制的较小的DNA分子;②能使带进去的DNA在细胞里面进行复制,并且仍然保持原有的特性;③作为运载体最好具有某些简单的特性,如抗药性、免疫性等。最理想的运载体是质粒。123451.对基因工程概念的理解(1)操作环境:体外环境。(2)优点:与杂交育种相比,克服了远缘杂交不亲和的障碍。与诱变育种相比,定向改变了生物的遗传特性。(3)操作水平:分子水平。(4)原理:基因重组。(5)本质:甲(供体:提供目的基因)乙(受体:表达目的基因),即基因未变,只是基因表达场所的转移。12345(6)基因工程得以实现的理论基础:DNA是绝大多数生物的遗传物质,所有生物的DNA都是以4种脱氧核苷酸为基本单位,构成独特的双螺旋结构,这为不同种生物的DNA拼接成功提供了物质基础。所有生物共用一套遗传密码子,为某种生物的基因能够在其他种类生物细胞内正常指导蛋白质的合成提供了可能。(7)基因工程的技术基础:基因转移载体的发现;工具酶的出现;DNA合成和测序技术的发明;DNA体外重组的实现;重组DNA表达实验的成功;第一例转基因动物问世;PCR技术的发明等等。123452.基因工程的基本原理和理论基础若强调“目的基因”的表达过程,则只包括“转录和翻译过程”,不包括目的基因的复制。123453.限制性核酸内切酶及其与解旋酶和DNA连接酶的区别(1)限制性核酸内切酶来源主要存在于微生物中作用特点特异性:只能识别和切割DNA分子中一小段特殊的核苷酸序列化学本质蛋白质作用催化作用:可重复使用;可用于目的基因的切割和运载体的切割作用结果形成黏性末端或平末端作用实质使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开12345切割的化学键为磷酸二酯键。在切割目的基因和运载体时,要求用同一种限制酶,目的是产生相同的黏性末端。将一个基因从DNA分子上切下来,需要切两处,同时产生4个黏性末端。不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同,同一个DNA分子用不同的限制酶切割,产生的黏性末端一般不相同。12345(2)限制酶与解旋酶的区别①相同点:都作用于DNA分子中的化学键。②不同点a.作用部位不同:前者作用于磷酸与脱氧核糖之间的磷酸二酯键,而后者作用于两个碱基之间的氢键。如下图所示,a处为限制酶作用位点,b处则为解旋酶作用位点。12345b.作用结果不同:限制酶在DNA分子特定部位切割DNA;DNA解旋酶是把双链DNA分子间氢键打开使双链DNA成为两个互补的单链。限制酶具有专一性,能识别特定的DNA序列,切出能互补配对的黏性末端或平末端。12345(3)限制酶与DNA连接酶的关系作用应用限制酶使特定部位的磷酸二酯键断裂用于提取目的基因和切割运载体DNA连接酶在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键将运载体与外源基因组成一个重组DNA分子两者的关系可表示为:12345①由于核苷酸分子间的氢键是分子间作用力,其断裂与重新形成均与限制酶、DNA连接酶无关。②限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。③DNA连接酶起作用时不需要模板。123454.DNA连接酶与DNA聚合酶的区别DNA连接酶DNA聚合酶作用实质连接DNA片段间的磷酸二酯键将单个核苷酸与DNA单链通过磷酸二酯键连接起来连接部位将两个DNA片段通过磷酸二酯键连接起来将单个脱氧核苷酸加到已经存在的核酸片段的3'羟基上连接DNA链双链单链是否需要模板不需要需要作用结果将两个DNA片段连接成重组DNA分子合成新的DNA分子123455.运载体(1)运载体的作用是将外源基因导入受体细胞并使其在受体细胞内稳定遗传并表达。目前,常用的运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒。(2)质粒的基本结构质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外、并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。(3)作为载体必须具备的条件具有自我复制能力以便在寄主细胞中稳定保存并大量复制;具有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中;具有特殊的标记基因,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等标记基因,供重组DNA的鉴定和筛选。12345(1)一般来说,天然运载体往往不能满足人类的所有要求,因此人们根据不同的目的和需要,对某些天然的运载体进行人工改造。(2)常见的标记基因有抗生素抗性基因、产生特定颜色的表达产物基因、发光基因等。(3)注意与细胞膜上载体的区别,两者的化学本质和作用都不相同。(4)质粒能自我复制,既可在自身细胞、受体细胞内复制,也可在体外复制。题型一题型二题型三题型四题型一基因工程的概念【典例1】下列有关基因工程的叙述,不正确的是()A.基因工程又叫作DNA重组技术B.对生物的基因进行改造或重新组合,定向地改造生物的遗传特性C.在医药卫生、农牧业和环境保护等方面有广泛的应用D.可对任何物种进行改造,控制生物的进化解析:基因工程又叫DNA重组技术或基因拼接技术,可以定向地改造生物的遗传特性,但是无法改造物种,更不可能控制生物的进化。答案:D题型一题型二题型三题型四题型二基因工程的工具酶——限制酶【典例2】下列关于限制酶的说法正确的是()A.限制酶广泛存在于各种生物中,但微生物中很少B.一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C.不同的限制酶切割DNA后都会形成黏性末端D.限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键解析:限制酶主要存在于微生物中,限制酶的作用部位是特定序列中两个核苷酸之间的磷酸二酯键。答案:B有关限制酶的知识需注意以下几点:(1)限制酶主要存在于微生物中,尤其是原核生物中;(2)限制酶具有特异性,不同的限制酶切割DNA的位点不同;(3)限制酶的作用主要是用来提取出目的基因。题型一题型二题型三题型四题型三基因工程的工具酶——DNA连接酶【典例3】下列有关说法正确的是()A.DNA连接酶和DNA聚合酶一样都需要模板,其目的都是合成DNA分子B.DNA连接酶不需要四种脱氧核苷酸作为原料C.DNA连接酶是在细胞核内合成的,而DNA聚合酶是在核糖体上合成的D.DNA连接酶连接的是氢键和磷酸二酯键解析:DNA聚合酶和DNA连接酶都是形成磷酸二酯键,只是前者是将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上,后者是将两个DNA片段通过形成磷酸二酯键连接起来;它们的化学本质都是蛋白质,都是在细胞内的核糖体上合成的。DNA聚合酶催化DNA单链合成时需要四种脱氧核苷酸作为原料,但是DNA连接酶催化DNA片段连接时不需要四种脱氧核苷酸作为原料。答案:B题型一题型二题型三题型四题型四基因工程的运载工具——运载体【典例4】作为基因的运载工具——运载体,必须具备的条件及理由是()A.能够在寄主细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因B.具有多个限制酶切点,以便于目的基因的表达C.具有某些标记基因,以便为目的基因的表达提供条件D.能够在寄主细胞中复制并稳定保存,以便于进行筛选解析:质粒能够稳定地在寄主细胞内复制的特性,可以达到大量繁殖目的基因的目的;具有多个限制酶切点,以便于外源DNA分子的插入;具有某些标记基因,以便于鉴定和筛选重组DNA分子。答案:A题型一题型二题型三题型四标记基因的作用是便于对目的基因是否导入受体细胞进行检测,起到筛选作用,但是目的基因是否表达不能用标记基因来检测,只能通过是否表现出目的基因相应的性状来判断。选择限制酶时,要考虑不能破坏标记基因的核苷酸序列,否则就失去标记基因的作用。1下列叙述符合基因工程概念的是()A.B淋巴细胞与肿瘤细胞融合,杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株C.用紫外线照射青霉菌,使其DNA发生改变,通过筛选获得青霉素高产菌株D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上解析:A选项所述内容属于细胞工程;C选项属于诱变育种;D选项属于噬菌体侵染细菌;B选项中将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌,获得能产生人干扰素的菌株,符合基因工程的概念和特点。答案:B123412342下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述,错误的是()A.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性核酸内切酶的活性受温度影响C.限制性核酸内切酶能识别和切割RNAD.限制性核酸内切酶可从原核生物中提取解析:本题考查基因工程中工具酶的有关知识。绝大多数酶的化学本质是蛋白质,少数酶的化学本质是RNA。酶的活性受温度和pH的影响;限制性核酸内切酶的特点是能识别双链DNA中特定的核苷酸序列,可在特定的位点进行切割;限制性核酸内切酶主要是从原核生物体内分离出来的。答案:C12343我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。获得耐盐基因后,为了构建重组DNA分子,在此过程中DNA连接酶作用的位点及相应的化学键为()A.a、磷酸二酯键B.b、氢键C.a、氢键D.b、磷酸二酯键解析:限制性核酸内切酶可以识别特定核苷酸序列并在特定的位点切割,由图可知在GA之间切割,即打开相邻碱基GA所代表的核苷酸之间的磷酸二酯键,故DNA连接酶作用的位点为a点,把打开的磷酸二酯键连接起来。答案:A12344下列关于基因工程的叙述,错误的是()A.目的基因和受体细胞均可来自动植物或微生物B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D.运载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达解析:基因工程中目的基因和受体细胞均可来自动植物或微生物;常用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶;人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性,只有经过一定的物质激活以后,才有生物活性。运载体上的抗性基因主要是有利于筛选含重组DNA的细胞,不能促进目的基因的表达。所以D项错误。答案:D