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第2节基因工程的操作程序1.描述基因工程基本操作的几个步骤。2.简述获取目的基因的方法。3.简述将目的基因导入受体细胞的方法。4.简述目的基因的检测和表达产物的测定方法。一二三四一、目的基因的获得1.目的基因是指人们所需要进行研究的基因。2.目的基因获取的方法主要有两种:化学合成法和从基因组中直接分离法。3.化学合成法是指利用化学反应直接合成基因。该方法主要适用于已知核苷酸序列的、相对分子质量较小的目的基因的制备。4.从基因组中直接分离法:是目前获得目的基因的主要手段。(1)方法一,鸟枪法分离基因的主要步骤:①提取基因组的DNA,然后进行“散弹射击”,即用限制性内切酶或其他机械方法将完整的双链DNA分子随机切割成适当长度的片段,这样某一DNA片段上可能刚好有所需要的目的基因。②把这些片段连接到合适的运载体上,通过运载体分别转入不同的受体细胞中,使外源DNA随着运载体的复制而复制,从而进行目的基因的增殖,使目的基因的信号放大。③采取合适的方法,对含有外源DNA片段的受体细胞进行检测,找出目的基因所在的运载体。(2)方法二,利用DNA扩增仪(PCR仪)直接扩增目的基因;也可以利用反转录法,以mRNA为模板,借助反转录酶,通过PCR仪合成与mRNA序列互补的DNA片段,然后在聚合酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的目的基因。一二三四一二三四二、基因表达载体的构建1.要想实现基因工程的蓝图,需要通过合适的运载工具把目的基因运到目的地。这就需要给目的基因寻找合适的运载体,通过运载体把目的基因输送到合适的位置,使目的基因在那里发挥作用。2.大肠杆菌质粒DNA的提取实验:最常用的方法是碱裂解法。原理是十二烷基硫酸钠(SDS)和NaOH溶液可使菌体破裂,从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性(NaOH)环境,就会变性。用乙酸钾(KAc)来中和溶液,使溶液处于中性,质粒DNA将迅速复性,而染色体DNA由于分子较大,难以复性。离心后,质粒DNA将在上清液中,而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。一二三四3.基因表达载体的构建:以质粒为例,首先要用限制性内切酶切割质粒,使环状质粒出现一个切口,露出DNA末端,然后用同样的限制性内切酶去切割目的基因,使目的基因暴露出同样的DNA末端。再在DNA连接酶的作用下,连接质粒和目的基因,形成含有目的基因的新的环状质粒DNA分子表达载体。4.除了质粒作运载体外,还可以用病毒作运载体。因为病毒很容易接近寄主细胞,人们把病毒的DNA分子进行改造,将病毒的有害基因去掉,换上目的基因,这样经过改造的病毒DNA分子用蛋白质“包装”之后,容易将目的基因送进寄主细胞中。三、目的基因的导入1.将目的基因导入的方法有:花粉管通道法、氯化钙法、农杆菌介导的遗传转化法、基因枪法以及电击法、聚乙二醇法等。2.花粉管通道法(1)概念:指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞,借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。(2)方法:①柱头滴加法:在授粉前后,将含目的基因的溶液加在柱头上。②花粉粒携带法:即用含目的基因的溶液处理花粉粒,让花粉粒吸入目的基因,然后授粉。3.氯化钙法如果运载体是质粒,受体细胞是大肠杆菌,最常用的遗传转化技术是氯化钙法。这一方法也是扩增表达载体的常用方法,受体细胞经过一定浓度的氯化钙处理后,细胞膜的通透性会发生变化,可以允许含有目的基因的运载体分子进入感受态细胞。一二三四一二三四4.农杆菌介导的遗传转化法(1)农杆菌是一种土壤细菌,它侵染植物细胞后,会使植物组织形成肿瘤。受感染的细胞可产生正常细胞所不能产生的生物碱,被农杆菌利用作为碳源和氮源。(2)农杆菌中存在一种环形的Ti或Ri质粒,它包含有生长素基因和细胞分裂素基因,可插入植物基因组引起植物细胞的变化。(3)由于TDNA转移频率很高,而且Ti质粒上可插入几百至几千个碱基大小的DNA片段,因此可以利用这种天然的遗传转化体系,将目的基因转移到植物细胞。(4)优点:转化频率高、成本低、操作简单,而且转基因后代的遗传组成比较容易分析。一二三四5.基因枪法(1)概念:把细胞看成靶子,用基因枪装上带有目的基因的微弹,对植物细胞进行轰击,这样,目的基因便像子弹一样,随着基因枪的强烈轰击,进入到受体细胞中。(2)主要原理:将连接到运载体上的目的基因的DNA溶液与金粉或钨粉共同保温,使DNA吸附于金属颗粒表面,然后在一个真空的小室中,利用高压放电将带有基因的金粉或钨粉轰击进入受体,实现转基因的目的。一二三四四、目的基因的检测与表达产物的测定1.形态检测(1)如果目的基因的表达产物具有明显的表型性状,那么,可以根据目标性状的有无来判断目的基因是否表达。(2)如果目的基因的产物没有明显的表型,在构建表达载体时,通常把一个报告基因与目的基因连在一起,通过检测报告基因的表达情况,来检测目的基因的表达;所用的报告基因通常是抗生素抗性基因或荧光标记基因。这样,通过检测受体细胞是否具有某种抗生素的抗性,或是否具有某种荧光标记,来追踪目的基因的表达情况。一二三四2.分子检测(1)PCR检测:根据目的基因的序列设计引物,采用PCR技术对目的基因进行扩增,如果能扩增出目的基因片段,说明目的基因已整合到受体细胞中。(2)分子杂交检测:把目的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物素荧光标记,用标记好的基因片段作探针,与受体生物的基因组DNA进行杂交,如果有杂交斑点,根据分子杂交的基本原理,说明目的基因与受体细胞基因组DNA具有同源性,也就是说目的基因已经被导入受体细胞内。反之,则说明目的基因没有进入受体细胞中。(3)进一步的分子检测:提取目的基因mRNA,检测目的基因的转录情况;分离目的基因编码的蛋白质,检测目的基因的表达情况。12341.目的基因的提取(1)化学合成法化学合成法是指利用化学反应直接合成基因。该方法主要适用于已知核苷酸序列的、相对分子质量较小的目的基因的制备。(2)从基因组中直接分离法以前经常采用的是“鸟枪法”,“鸟枪法”分离基因的主要步骤是:首先提取基因组的DNA,然后进行“散弹射击”,即用限制性内切酶或其他机械方法将完整的双链DNA分子随机切割成适当长度的片段,这样某一DNA片段上可能刚好有所需要的目的基因;然后把这些片段连接到合适的运载体上,通过运载体分别转入不同的受体细胞中,使外源DNA随着运载体的复制而复制,从而进行目的基因的增殖,使目的基因的信号放大,再采取合适的方法,对含有外源DNA片段的受体细胞进行检测,找出目的基因所在的运载体。方法之二是利用DNA扩增仪(PCR仪)直接扩增目的基因,也可以利用反转录法,以mRNA为模板,借助反转录酶,通过PCR仪合成与mRNA互补的DNA片段,然后在聚合酶的作用下合成双链DNA,从而获得所需要的目的基因。12342.基因表达载体的构建1234(1)目的基因是指编码蛋白质的结构基因,没有启动子,若只将目的基因导入受体细胞中无法转录,所以目的基因的表达载体必须有启动子,同时在插入目的基因的位置后面还必须有终止子。(2)为检测目的基因是否导入受体细胞,还必须有检测标记——报告基因(标记基因)。因此,一个基因表达载体的组成应该包括启动子、终止子、目的基因、报告基因(标记基因)等。终止子是指DNA分子上决定转录停止的一段核苷酸序列;终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻的碱基。12343.目的基因导入受体细胞(1)花粉管通道法①概念:利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管向子房注入含目的基因的DNA溶液,将外源DNA导入受精卵细胞,并进一步地被整合到受体细胞的基因组中,随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于20世纪80年代初期由我国学者周光宇提出,我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。②优点:可以应用于任何开花植物;利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞进行转化,直接获得的产品即是转基因植株;在转基因植株表达的目标性状的鉴定上,完全可以直接针对目标性状的表现型来进行,从而可以避免一般情况下依赖于植物组织培养时的鉴定过程中,大量依赖于抗生素进行筛选的弊端。1234③缺点:进行外源基因转化目标植物的工作时间受自然花期限制,同时必须充分了解每一种植物的开花受精的时间过程;在自然田间进行操作,受环境条件的影响很大;由于转基因以随机的方式整合进入受体细胞染色体基因组中,故转基因工程植株的后代的遗传情况较为复杂。花粉管通道法的操作的经验性很强,需要一定的技术摸索和技巧。另一方面,对单子叶的小花农作物的操作难度较大,由于获得大量的转基因种子比较困难,故工作效率也较低。1234(2)氯化钙法①概念:如果运载体是质粒,受体细胞是大肠杆菌,最常用的遗传转化技术是氯化钙法。这一方法也是扩增表达载体的常用方法,受体细胞经过一定浓度的氯化钙处理后,细胞膜的通透性会发生变化,可以允许含有目的基因的运载体分子进入感受态细胞。②影响转化效率的因素很多,主要有:感受态细胞制备的质量、受体菌生长期(大肠杆菌在对数生长期易产生感受态)、质粒的大小和构型、所用试剂的纯度、接种前菌种的保藏方式、冰浴时间(延长冰浴时间可略微提高转化率)、器皿的清洁度、化合物及无机离子、质粒与细胞个数的比例(质粒与细胞个数比例在1∶1以下时,转化率随着加入DNA的量增加而呈线性增加)。1234(3)农杆菌介导的遗传转化法农杆菌是一种土壤细菌,它侵染植物细胞后,会使植物组织形成肿瘤。受感染的细胞可产生正常细胞所不能产生的生物碱,被农杆菌利用作为碳源和氮源。农杆菌中存在一种环形的Ti或Ri质粒,它包含有生长素基因和细胞分裂素基因,而且Ti质粒上可插入植物基因组引起植物细胞的变化。由于TDNA转移频率很高,而且Ti质粒上可插入几百至几千个碱基大小的DNA片段,因此可以利用这种天然的遗传转化体系,将目的基因转移到植物细胞。优点是转化频率高、成本低、操作简单,而且转基因后代的遗传组成比较容易分析。1234(4)基因枪法①概念:把细胞看成靶子,用基因枪装上带有目的基因的微弹,对植物细胞进行轰击,这样,目的基因便像子弹一样,随着基因枪的强烈轰击,进入受体细胞中。②主要原理:是将连接到载体上的目的基因的DNA溶液与金粉或钨粉共同保温,使DNA吸附于金属颗粒表面,然后在一个真空的小室中,利用高压放电将带有基因的金粉或钨粉轰击进入受体,实现转基因的目的。4.目的基因的检测与表达产物的测定方法形态检测包括做抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较,以确定功能是否相同分子检测PCR检测根据目的基因的序列设计引物,采用PCR技术对目的基因进行扩增,如果能扩增出目的基因片段,说明目的基因已整合到受体细胞中分子杂交检测把目的基因片段进行放射性同位素标记或进行生物素荧光标记,用标记好的基因片段作探针,与受体生物的基因组DNA进行杂交,如果有杂交斑点,说明目的基因已经被导入受体细胞内PCR检测和分子杂交检测只能说明目的基因是否整合到受体生物基因组中,而目的基因在受体基因组中是否转录表达,还要经过进一步的分子检测来证明。比如,提取目的基因的mRNA,检测目的基因的转录情况;分离目的基因编码的蛋白质,检测目的基因的表达情况。1234题型一题型二题型三题型四题型一基因工程技术的操作【典例1】天然的玫瑰没有蓝色花,这是由于缺少控制蓝色色素合成的基因B,而开蓝色花的矮牵牛中存在序列已知的基因B。现用基因工程技术培育蓝玫瑰。下列操作正确的是()A.提取矮牵牛蓝色花的mRNA,经逆转录获得互补的DNA,再扩增基因BB.利用限制性核酸内切酶从开蓝色花矮牵牛的基因文库中获取基因BC.利用DNA聚合酶将基因B与质粒连接后导入玫瑰细胞D.将基因B直接导入大肠杆菌,然后感染并转入玫瑰细胞解析:可以利用mRNA经逆转录合成目的基因后再进一步扩增,A项正确。基因文库中的目的基因是将目的基因与运载体结合形成的重组质粒,所以获取时不需要限制性核酸内切酶,B项错误。目的基因必须