泛素-蛋白酶体及其抑制剂的分类与合成

药学学报ActaPharmaceuticaSinica2009,44(12):1313-1319·1313·泛素-蛋白酶体及其抑制剂的分类与合成李景,张大永*,吴晓明(中国药科大学药学院,江苏南京210009)摘要:泛素-蛋白酶体是人体内降解蛋白质的主要途径,通过该酶体来抑制蛋白质的降解是近年来治疗癌症的新策略,同时还扩大了化学治疗药的靶标。该蛋白酶体调控着人体内非必需或废弃细胞蛋白的降解,这一过程在许多癌症细胞中往往调控紊乱。基于这个靶标,治疗多发性骨髓瘤的二肽硼酸类化合物Bortezomib,在2003年得到了FDA的批准,成为该靶点第一个成功上市的药物。随后一系列具有蛋白酶20S抑制活性的合成小分子化合物或提取的天然化合物进入临床实验。本文主要综述了蛋白酶体的结构、蛋白酶抑制剂的作用机制及其抑制剂的合成与分类。关键词:蛋白质的降解;泛素-蛋白酶系统(UPP);抑制剂;抗肿瘤活性中图分类号:R916文献标识码:A文章编号:0513-4870(2009)12-1313-07Classificationandsynthesisofubiquitin-proteasomeinhibitorLIJing,ZHANGDa-yong*,WUXiao-ming(SchoolofPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China)Abstract:Theinhibitionofproteindegradationthroughtheubiquitin-proteasomepathwayisarecentlydevelopedapproachtocancertreatmentwhichextendstherangeofcellulartargetforchemotherapy.Thistherapeuticstrategyisveryinterestingsincetheproteasomescarryouttheregulateddegradationofunnecessaryordamagedcellularproteins,aprocessthatisdysregulatedinmanycancercells.Basedonthishypothesis,theproteasomecomplexinhibitorBortezomibwasapprovedforuseinmultiplemyelomapatientsbyFDAin2003.Drugdiscoveryprogramsinacademyandthepharmaceuticalindustryhavedevelopedarangeofsyntheticandnaturalinhibitorsofthe20Sproteasomecoreparticlethathaveenteredhumanclinicaltrialsassignificantanti-cancerleads.Themainresultsfromtheuseofproteasomeinhibitionincancerchemotherapy,thestructureofseveralproteasomeinhibitorsandtheirsynthesisisgoingtobereviewedinthispaper.Keywords:proteindegradation;ubiquitin-proteasomepathway;inhibitor;anti-canceractivity1泛素-蛋白酶体的结构和功能人体内各种细胞的稳态以及功能的正常发挥有赖于机体内严格的分子调节机制,其中一个重要的方面就是各种生理过程中蛋白质的及时降解,如细胞分裂、生长发育、信号的转导及细胞的凋亡等过程[1]。如果细胞内蛋白质的降解过程受到阻碍,细胞中将积累大量的蛋白质,会影响细胞分裂周期中G1期到S期的转变。在真核细胞中,90%的蛋白质降解收稿日期:2009-04-01.*通讯作者Tel/Fax:[phone],E-mail:[e-mail]过程都是通过泛素-蛋白酶系统(UPP)来完成,从而来调控信号传导、炎症反应等生理活动。核心蛋白酶体(26S)是一个ATP依赖性蛋白水解酶复合体。蛋白酶体的活性对细胞功能的维持非常重要。26S蛋白酶体对蛋白的降解依赖于靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白的识别两个过程。蛋白酶体抑制剂能通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞原有的功能,对肿瘤细胞的生长产生抑制作用。同时,利用蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体的酶切位点活性也成为免疫、炎症等研究的热点。体内需要降解的蛋白质首先要接受一个泛素化·综述··1314·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2009,44(12):1313-1319的过程(图1)。泛素活化过程是一个依赖ATP水解酶的过程。其中包括3个主要的蛋白酶体:泛素活化酶E1(ubiquitin-activatingenzyme)、泛素结合酶E2(ubiquitin-conjugatingenzyme)和泛素连接酶E3(ubiquitin-ligaseenzyme)。经过泛素酶E1、E2、E3活化后的蛋白质才能被蛋白酶体26S所识别[2,3]。26S蛋白酶体主要由20S的催化中心和19S的调节颗粒两部分组成。20S的催化中心由两个相同的α环和β环组成,形成一个环状的αββα圆柱体结构。外围由α单位组成,内环由β单位组成,每个环各有7个相同的亚单位。催化蛋白质降解的活性部位位于β亚基的内表面上。19S的调节颗粒像一个帽子盖在催化中心的两端,具有伴侣分子似的ATP酶活性,其主要作用是识别已经泛素化的蛋白质,移除蛋白质上的泛素酶,重新折叠蛋白质,再将其转运至20S催化中心。β环是催化中心的主要部位,其中β1、β2、β5是复合体酶的主要催化部位,分别具有类糜蛋白酶活性(ChTL)、类胰蛋白酶活性(TL)、蛋白酶样活性[4]。这些蛋白酶可以水解蛋白质上的特定氨基酸,从而水解蛋白质,释放多肽类物质。虽然蛋白酶体上具有3个酶活性部位,但目前研发的小分子物质主要抑制其中的一个或两个来阻止蛋白的降解,如Bortezomib只抑制类糜蛋白酶,对其他的两个酶没有影响[5]。2蛋白酶抑制剂的抗癌机制用蛋白酶抑制剂抑制体内蛋白质的分解,将会使体内蛋白质的调节失衡,细胞分裂周期将会停留在G1—S和G2—M期,同时机体对蛋白质的降解也会发生一系列的补偿代谢,激活胞外降解蛋白质的途径。因此,先前有学者认为,抑制蛋白酶体的活性,蛋白质的调节将紊乱,有可能会导致肿瘤的发生、药物耐受和免疫力下降等问题[6]。在临床研究中发现应用蛋白酶抑制剂后,机体内一些关键调节蛋白将积聚在细胞质中,如与NF-κB相关的IκB抑制剂、肿瘤抑制基因p53、细胞周期依赖酶抑制剂p21和p27及Bax蛋白等。调节蛋白浓度的增加将会降低NF-κB的激活,肿瘤抑制基因p53的表达会增加,p21和p27的增加将会使细胞周期调节失衡,依赖Bax蛋白酶的Bcl-2抑制剂的增加将加速细胞的凋亡[4,7]。同时,蛋白酶体功能受到抑制会阻碍细胞信号的传导,其中包括通过有丝分裂原激活蛋白激酶家族(MAPK)中由ERK1和ERK2调节的肿瘤基因。研究发现,和正常细胞相比,癌细胞对蛋白酶抑制剂更敏感,如乳胞素(lactacystin)对正常的淋巴细胞无明显作用,而对肿瘤细胞的作用明显。其中原因现在还未有定论,有学者指出可能是因为在肿瘤细胞中蛋白质的运转周期短,使其对蛋白酶抑制剂的敏感性增加[7]。Masdehors等[8]发现B-CLL细胞中,ChTL活性水平是正常淋巴细胞的3倍,其蛋白的泛素化水平也高于正常细胞。还有人认为在肿瘤细胞中,抑制剂与蛋白酶的作用时间比在正常细胞更长,也有人认为和正常细胞相比,抑制剂在癌细胞中的降解速度慢,作用时间长,从而达到治疗癌症的目的[4,9]。Li[10]认为,泛素-蛋白酶体在哺乳动物细胞生长发育过程中,其功能是不可替代的。临床实验证明在前列腺癌症患者中,体内低水平的Bax蛋白将会加速蛋白质的降解,使癌症恶化的几率上升。应用蛋白酶Figure1Ubiquitinationanddegradationprocessofproteininvivo李景等:泛素-蛋白酶体及其抑制剂的分类与合成·1315·抑制剂后,阻止了Bax蛋白的降解,细胞质中Bax蛋白活性增加,导致细胞凋亡,达到抑制癌症的目的。在进一步的研究中,发现当肿瘤细胞对其他药物出现耐受时,蛋白酶抑制剂对其仍有较好的治疗效果,而将其他化疗药物或治疗手段和蛋白酶抑制剂同时作用时,治疗癌症的效果更好[9,11,12]。但其作用机制至今还未研究清楚。从发现泛素-蛋白酶系统开始,各国科学家就开始研究开发各种各样的蛋白酶体抑制剂,从合成的小分子化合物到提取的天然化合物,其结构也有很大的差异,但其与蛋白酶体的作用方式基本相同,大多都是作用于核心蛋白酶体20S的β1、β2和β5亚基,与其发生可逆或不可逆的结合,占据降解蛋白质的结合位点,蛋白质降解过程受阻,细胞分裂周期停滞[9,12−14]。在蛋白酶的催化中心20S中,N-末端是一个苏氨酸残基,残基中的-OH基团有较好的亲核性。20S中催化蛋白质底物的活性部位也正是这个苏氨酸残基的-OH。后文介绍的各种抑制剂均是通过和这个亲核性基团结合,达到可逆或不可逆的效果,因此可以说蛋白酶抑制剂是一类缺电子的化合物,具有亲电性。如Bortezomib与蛋白酶体20S作用时的可逆过程和salinosporamidesA作用时的不可逆过程(图2)[9,10]。3蛋白酶抑制剂的分类与合成蛋白酶体活性的变化会使细胞执行不同的生理功能,蛋白酶体已经成为开发新型抗肿瘤药物的一个重要靶标,其抑制剂比其他抗肿瘤药物在耐受性方面具有更大优势。根据化学结构蛋白酶抑制剂可分为醛基肽类、硼酸肽类、β-内酯类、TMC-95A及其衍生物和乙烯基磺酸类化合物等(图3)。3.1醛基肽类(aldehydepeptide)醛基肽类化合物(主要是醛基三肽)是最早用于研究蛋白酶抑制剂的一类化合物,最早研究的主要有钙蛋白酶抑制剂Ⅰ(Ac-Leu-Leu-nLeu-al)和天然放射菌类产物亮太素(Ac-Leu-Leu-Arg-al)、MG-132、CEP-1612、CVT-634等。通过此类化合物的研究证实蛋白酶复合体的催化中心是N-末端的苏氨酸残基[10]。该类化合物通过结构中的醛基和催化中20S的β1和β2苏氨酸残基的-OH结合,形成一个半缩醛的结构,可逆性的抑制蛋白酶复合体的活性。这种类型的天然化合物大多数作用强度较低和选择性不好,但合成的三肽类衍生物效果明显,且选择性更高。2004年,合成出一个新的三肽类化合物(酪氨酸化合物(tyropeptinA)),药效强度有所增强,并以其作为先导化合物,通过计算机辅助药物设计等手段对该系列衍生物进行构效关系研究,虚拟筛选出TP-104(结构中的异丁基换成萘甲基)和TP-110(TP104上的两个羟基甲基化)两个活性较好的化合物[15]。此类化合物结构简单,通过两次氨基酸的缩合合成目标化合物。以tyropeptinA的合成(合成路线1)为例来介绍这类化合物的合成:化合物1中两个-OH先用苄基保护,用Boc试剂保护化合物中的氨基;在三氟甲磺酸的催化下,Boc氨基端加上一个Boc-L-Val,得到化合物2;用同样方法在2的末端加上Boc-L-Tyr和异丁酸得到三肽;酰胺三肽水解除去苄基保护基,氧化后得到目标化合物tyropeptinA[15,16]。其他tyropeptinA三肽类衍生物,如TP-104和TP110的合成方法与tyropepeinA的合成方法类似。3.2硼酸肽类硼酸肽类化合物是现阶段最重要的蛋白酶抑制剂。体外细胞和动物体内实验均结果表Figure2ProteasomeinhibitorBortezomibandsalinospor