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Ficollor洗涤Il-2、CD3（500IU/ml）2hrs1mlvirus+1.5mlmedium+1.5~2MCell48hr洗涤、Il2、培养液扩增48hrsFab4℃~-80℃~-130℃程控冻存冻存液（HSA,电解质，DMSO），≤300Million，1dose：1MCAR-T/kg（50kg~50M/10%~500M）~4dose表型（FAB）、活力、无菌、内毒素输注液transduction二代3质粒包装系统从患者体内的外周血中分离白细胞患者外周血采集激活（active）冻存（慢冻）Active(速融)转导分装冻存分析检验产品放行冻存细胞液氮运输至目的地解冻回输（速融）跟踪反馈RecoveryCAR-Tcell≤10days滴度检测FAB稳定性编码CAR的慢病毒载体Lenti-X293T细胞[Active+培养]6hrs2%FBS+DMEM+2%HEPES+0.2%丁酸钠换液-培养DMEM+10%FBS检验来源，鉴定：Takara购买E.oli菌株:USA实验室制备，含CD4/CD19/CLL33/BCMA质粒来源，鉴定：Takara购买Lenti-X293T细胞传代操作流程Plasmid/DNA制备流程载体包装制备流程种子库主库MCB工作库WCB种子库主库MCB工作库WCBCAR-T细胞免疫治疗流程CAR-T制备申请单~产品主批号副批号1收获100mlLB培养过夜的细菌副批号2副批号3包装plasmid(pMD2.G，pSPAX2)PBS作稀释用5ug10ug在6000g，4℃,离心15min。复苏10mlBufferP1重悬目的DNA(22.5ug)CaCl2→Water→20min→HBS[HEPES(x2)]碱裂解PlasmidGIGAKIT扩增1:3~510mlBufferP2transfection剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。48h换液一次60-70%融合度10ml冰浴的BufferP3收获AIMV，RPMI，FBS，Il-2，CD3同上混匀24hrs≥90%活力过滤器室温放置10min，轻轻挤压活塞（或抽滤）将溶菌产物过滤到50ml离心管中冻存4℃~-80℃~-130℃程控冻存LABEL：RPMI病毒粗液过滤0.22μm+浓缩(沉降)加入2.5mlBufferER冻存稳定性？复苏后活力应≥80%，每8~12代检查一次活力充分混匀后冰孵30min补液，培养QIAGEN-tip500柱病毒粗液过滤0.22μm+浓缩(沉降)加入10mlBufferQBT，重力滴下排空24hrsFBS：2%维持，10%加速1dose=1millionCART/kg×WT(kg)一般≤300million加入孵育的溶菌液补液，培养重力慢慢滴下生产用细胞：群体扩增水平（细胞增长倍数）为代次数，即扩增一倍为一代；2×30mlBufferQC病毒液15mlBufferQN洗脱DNA10.5ml异丙醇传代用细胞：每稀释一次，即每传一次为一代。洗脱液-80℃冻存备用编码CAR的慢病毒载体≥15000×g，4℃离心30min浓缩沉淀5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中)，15000g，4℃离心10min病毒种子库的建立及管理洗涤建立针对载体安全性、无菌、纯度、效能、特性以及浓度测定的质量控制试验TE重新溶解DNA检测质粒浓度-20℃冻存备用1.收到患者血液2.供着信息3.Ficol过程及结果4.Car制备过程5.细胞包装情况6.回输剂量及时间，回输次数7.恢复状况8.出院情况