MicroRNA研究策略

转化医学研究及SCI论文策略主办：湖南省生物医学信息专业委员会湖南省赢通基因与细胞工程技术研究中心生物医药科研网承办：赢润生物重庆迈凯科技有限公司能润医学讲座主线一.MicroRNA简介二.MicroRNA的检测三.MicroRNA的过表达四.如何下调MicroRNA五.MicroRNA靶基因验证实验六.MicroRNA相关SCI论文实例2011年12月（miRNA）是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA。其在细胞内具有多种重要的调节作用。网状作用模式：每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。miRNA数据库：年12月两个概念：pri-miRNApre-miRNAMaturemiRNAmiRNA的种子序列（seedsequence）：成熟miRNA的5’端的第2～8位核苷酸与靶mRNA3’端的非翻译区（UTR）部分序列的结合很重要，被称为种子序列。二.MicroRNA的检测MicroRNA芯片优点：高通量缺点：成本高；难区分前体miRNA和成熟miRNANorthernblot优点：能比较直观的反映miRNA的表达量高低缺点：步骤复杂；难区分前体miRNA和成熟miRNA2011年12月miRNAqPCR检测（Real-timePCR）优点：可区分前体miRNA和成熟miRNA；检测灵敏度高；高特异性；成本较低难点：MaturemiRNA很短，如何检测？解决方法：加长序列2011年12月检测：Stem-loop法2011年12月检测：PolyA加尾法2011年12月Stem-loop法优点：特异性高缺点：每做一次RT，只能检测一个miRNA代表厂家：ABI、AmbionPolyA加尾法优点：通用性高；一次RT可以检测多个miRNA缺点：特异性稍差代表厂家：Qiagen2011年12月pre-miRNAMaturemiRNA载体形式载体形式化学合成：mimicsCMV启动子~600bp转染效率高可长期表达可带荧光U6/H1启动子70~600bp可带荧光可长期表达转染效率高miRNA成熟序列价格较高价格较高可进行各种修饰可带荧光作用时间短转染效率有时较低价格较低2011年12月结构：CMVp---EGFP---pri-miRNA---PolyApre-miRNA结构：hU6p---pre-miRNA---TTTTTT人工pri-miRNA结构：CMVp---EGFP---mir30左臂---pre-miRNA---mir30右臂---PolyA2011年12月范例2011年12月构建用载体2011年12月范例2011年12月范例2011年12月：pri-miRNA过表达，miRNA能够提升多少？（1）如果目的细胞中已有miRNA的高表达：大约提升2~5倍。（2）如果目的细胞中目的miRNA低表达或无表达：大约能提升50~1000倍。2011年12月如何下调miRNA，实现loss-of-function研究？（1）化学合成的miRNAantisensoligo。优点：比较经济；合成时间较短缺点：作用时间短；转染效率受限制2011年12月（2）载体形式的miRNAinhibitor。优点：可长期稳定作用；转染效率高缺点：构建周期较长2011年12月方法一：miRNAsponge2011年12月miRNAsponge作用效果2011年12月方法二：miRNADecoy（TuDRNAs）2011年12月miRNADecoy作用效果2011年12月’UTR部分3’UTRβ-gal2011年12月年12月检测方法（1）miRNA靶标载体、内参荧光素酶载体、miRNAmimics或miRNA过表达载体共转染。（2）带有内参荧光素酶的miRNA靶标载体、miRNAmimics或miRNA过表达载体共转染。然后做双荧光素酶检测实验。2011年12月进一步确定目的miRNA和靶基因之间的关系（1）构建含突变靶位点的miRNA靶标载体。其它步骤同前。（2）靶基因表达检测：目的miRNA上调或下调过程中，靶基因表达量的变化情况。2011年12月机制研究目的miRNA靶基因细胞表型下游基因2011年12月论文实例SCI论文实例一影响因子：2.82011年12月第一步：通过预测软件选取待选miRNA（58个）2011年12月第二步：构建待选miRNA的过表达载体2011年12月年12月第三步：双荧光素酶检测实验2011年12月第四步：miRNA对目的基因表达量的影响2011年12月第五步：进一步验证miR-503与CCND1的关系2011年12月细胞表型水平的验证：2011年12月SCI论文实例二影响因子：8.152011年12月第一步：发现组织和细胞中miR-205表达差异2011年12月第二步：过表达miR-205，发现细胞增殖受到抑制2011年12月表达上调后，肿瘤细胞的侵袭能力下降2011年12月第三步：选择靶基因，双荧光素酶检测实验2011年12月第四步：miR-205上调对靶基因表达量的影响2011年12月SCI论文实例三影响因子：~282011年12月第一步：针对目的基因，选择待选的miRNA（软件）2011年12月第二步：进一步实验验证miR-101和EZH2之间的关系（1）双荧光素酶检测（2）过表达miR-101及其它几种miRNA，检测EZH2表达2011年12月检测2011年12月第三步：研究miR-101、EZH2、细胞表型之间的关系细胞增殖：2011年12月成瘤实验2011年12月第四步：机制研究2011年12月第五步：结论2011年12月研究思路之二确定目的基因miRNAqPCR检测Northern检测确定欲研究的miRNA确定若干个目的miRNAmicroRNA芯片检测miRNA上调或下调靶基因验证实验基因表达检测细胞表型检测2011年12月赢润生物：数万个cDNA克隆和ORF克隆；六百多种常用载体及菌株；几十种启动子数据尚未完全录入，请QQ、Email或电话咨询。基因库：赢润生物技术支持基因库、载体库、RNA干扰、病毒包装：孙永林（手机：[phone]；QQ：12695920；Email：[e-mail]）分子生物学、细胞生物学、蛋白质及免疫学：刘彩云（手机：[phone]；QQ：15887251；Email：[e-mail])赢润技术服务重庆独家代理商——重庆迈凯科技有限公司邓显锋（手机：130