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2015/10/1521．试验动物的种属和品系–最好用两种种属的动物–啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔–非啮齿类：狗或猴●急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。●而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验选择大鼠或小鼠。⒉试验动物的年龄和体重：–急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～12kg。–同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。3.试验动物的性别：–急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。–如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。–如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。4.动物数量与随机分组：–5-7组–大、小鼠等小动物（每组不少于10只）–狗等大动物（每组6只）–分组原则——随机化原则黄色为个位数号码，红色为十位数号码。一般以头部为1号，按顺时针方向依次编号：右前肢为2号，右腰为3号，右后肢为4号，尾根部为5号，左后肢为6号，左腰为7号，左前肢为8号，后背为9号，10号为在头部染红色标记。编号与分组编号与分组根据上述方法，请判断这两只动物分别代表几号？2015/10/1535.实验动物的预检：–选择健康动物–1~2周的检疫期6.禁食：–经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食–大鼠、小鼠——隔夜进食–大动物——每日上午喂食前染毒–染毒后继续禁食2~4h，但在禁食时要保障饮水（二）试验动物的饲养环境–恒定的温度：22±3℃–湿度：30~70%–照度：昼夜各半–饲料合格、饮水合格、垫料合格（三）染毒途径的选择染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。•经口(胃肠道)接触1、灌胃2、吞咽胶囊:按剂量置胶囊中3、掺入饲料法（喂饲法）:自行摄入急性28天90天慢性一般大鼠10mg/kg小鼠20mg/kg不超过10mg/kg不超过10mg/kg大鼠最大20mg/kg犬15mg/kg溶媒为水大鼠最大20mg/kg小鼠最大40mg/kg大鼠最大20mg/kg犬15mg/kg大鼠最大20mg/kg犬15mg/kg溶媒为油不超过4mg/kg不超过4mg/kg不超过4mg/kg•经呼吸道接触人工染毒：——气管注入自行吸入：——静式吸入——动式吸入静式吸入:将实验动物置于一个有一定体积的密闭容器内，加入定量的易挥发的液态化合物或一定体积的气态化合物，在容器内形成所需要的受试化合物浓度的空气环境。最低需气量：小鼠-3.45L/h大鼠-30.5L/h常规方法：50L2h小鼠6-10只/柜大鼠1只/柜2015/10/154实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系动物种属呼吸通气量(L/小时)最低需气量(L/小时)不同容积染毒柜放置动物数(只)25L50L100L300L小鼠大鼠1.4510.182.4530.53~56~10112~151~236~405~6动式吸入:•是指实验动物处于空气流动的染毒柜中,染毒柜装置备有新鲜空气补入与含受试化合物空气排出的动力系统和随时补充受试化合物的配气系统•由染毒柜、机械通风系统、配气系统三部分组成动式染毒柜模式图•经皮肤接触定性试验：为考察一个外来化合物能否经皮吸收引起中毒，可先进行定性试验。小鼠或大鼠的浸尾试验是常用的定性试验方法。定量试验：是在实验动物已脱好毛的部位定量涂布受试化合物，以求该化合物经皮吸收的剂量－反应关系，求经皮LD50。脱毛面积S=10.4×W×0.667•注射途径接触用于比较毒性研究，以及化合物的代谢、毒物动力学和急救药物筛选等研究几种动物不同注射途径注射量(ml)范围注射途径小鼠大鼠豚鼠兔狗静脉肌肉皮下腹腔0.2~0.50.1~0.20.1~0.50.2~1.01.0~2.00.2~0.50.5~1.01.0~3.01.0~5.00.2~0.50.5~1.02.0~5.03.0~100.5~1.01.0~3.05.0~10.05.0~15.02.0~5.03.0~10.05.0~15.0(四)染毒剂量与分组:1．查阅文献①了解化学毒物的结构式/分子量/常温常压下的状态/熔点/沸点/密度/闪点/挥发度/蒸气压/水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等②确定用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍恩法等③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。2015/10/1552．预试验①设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。②根据确定的剂量组进行染毒。③根据预试验的死亡资料确定组距。可根据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。组别剂量（mg/kg）对数值12.51.602－0.6×2210.01.602－0.6×1340.01.6024160.01.602＋0.6×25640.01.602＋0.6×2急性毒性大鼠经口预试验剂量设计组距：剂量间4倍差，取对数值lg4=0.6)3．正式试验•根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定组数。例如概率单位法、寇氏法一般设6～10个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后．以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。123456•LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i•••（五）试验周期与毒效应观察1.中毒症状2.体重•在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻；若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。•对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物,应在观察期14天内称量其体重的变化．以便了解受试物引起毒效应的持续时间。3.病理检查及其他指标:•急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。•对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查．必要时做组织病理学检查。•根据试验需要可进一步扩大观察项目．如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。2015/10/1564.死亡和死亡时间•重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。三、急性毒性评价我国急性毒性（LD50）剂量分级表[GB15193.3-2003]急性毒性分级大鼠经口LD50（mg/kg）相当于人的致死量mg/kgg/人极毒＜1稍尝0.05剧毒1~50500~40000.5中等毒51~5004000~300005低毒501~5 00030000~25000050实际无毒5 001~15 000250000~500000500无毒＞15 000＞5000002500外源化学物急性毒性分级(WHO,2003)毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小时死亡2～4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(mg/kg)对人可能致死剂量g/kg(g/60kg)剧毒＜1＜10＜5＜0.050.1高毒1～10～5～0.05～3中等毒50～100～44～0.5～30低毒500～1000～350～5～25微毒5000～10000～2180～＞15＞1000四种不同外源化学物的LD50及剂量/反应(死亡)关系曲线利用LD50来比较不同外源化学物急性毒性大小最小致死剂量(MLD)估计•如果急性毒性试验得到较好的剂量-反应关系，则可直接计算LD0l(使一组实验动物1％死亡的剂量)，并以LD0l作为MLD的估计值。实际上，即使得到很好的剂量-反应关系曲线，LD0l的可信限将是相当宽的，并包含了MNLD(最大非致死剂量)。(六)经典急性毒性试验的局限性–1.消耗的动物量大–2.获得的信息有限–3.测得的LD50仅仅是一个近似值，波动大–4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。2015/10/157五种化合物的LD50值的实验室间变异化合物范围(mg/kg)比值(最大值／最小值）五氯酚74～6208.38水杨酸钠930～23282.50苯胺479～11692.44乙酰苯胺723～30604.23氯化镉105～4824.591、固定剂量法•由英国毒理学会于1984年正式提出；•设固定剂量以观察动物的试验反应；•观察指标是“明显毒性”(clearsignontoxicity),不以死亡为依据,而是按毒性症状来判断受试物质的毒性；•结果不是具体的LD50值。结果判定分为高毒、有毒、有害和毒性未分类（不分级）附急性毒性替代试验预试验•以5、50、500和2000mg/kg四个固定剂量进行试验•根据受试物的有关资料，从上述剂量中选择一个作为初始剂量；若无有关资料可作参考时，可用500mg/kg作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。•如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。•每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察7天。正式试验•在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，50mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验。•5mg/kg,50mg/kg,500mgkg,最高2000mg/kg存活率低于100%存活率等于100%存活率低于100%存活率等于100%高毒有毒有害500mg/kg存活率等于100%无毒性表现2000mg/kg存活率等于100%无严重急性中毒的危险50mg/kg，10只动物5mg/kg有毒性表现无毒性表现剂量(mg/kg)试验结果存活数100%100%存活毒性表现明显100%存活无明显中毒表现5高毒(Verytoxic)(LD50≤25mg/kg)有毒（Toxic）（LD5025-200mg/kg）用50mg/kg试验50有毒或高毒，用5mg/kg进行试验有害（Harmful）（LD50200-2000mg/kg）用500mg/kg试验500有毒或有害，用50mg/kg试验LD502000mg/kg用2000mg/kg试验2000用500mg/kg试验该化合物无严重急性中毒的危险性固定剂量法试验结果的评价2015/10/1582、限量试验•如受试物的毒性很低，可用限量试验。•一般啮齿类(大或小鼠)20只，也有用10只，雌雄各半。•灌胃剂量至少10g／kg体重，如不能达到10g/kg，则给予动物最大剂量