显微镜荧光波长详解

人肉眼对光源波长的颜色感觉红色770-622nm橙色622~597nm黄色597~577nm绿色577~492nm蓝靛色492～455nm紫色455～350nm荧光类型生产厂家激发光（nm）发射光（nm）颜色GFP蛋白395-495509绿色EGFP蛋白487509绿色DAPI358-360460-461蓝色AlexaFluor488Invitrogen495519绿色AlexaFluor594Invitrogen590617红色FITC490-495520-530黄绿色罗丹明(Rhodamine)565590红色TRITC(TetramethylRhodaminIsothiocyanate，四甲基异硫氰酸罗丹明,是罗丹明的一种衍生物之一)550620橙红色RhodamineRed-X(RRX)570590橙红色TexasRed(TR)589-595615橙红色常见显微镜滤光片的波长在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。红色滤光片G-2AEx510-560DM575BA590绿色滤光片B-2AEx450-490DM505BA520蓝色滤光片UV-2AEx330-380DM400BA420其它荧光染料介绍【菁类染料-Cyaninedyes(Cy2,Cy3,Cy5)】Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC,在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。Cy3在氩光灯(514nm或528nm)下可以被激发出50％的光强，在氦氖灯(543nm)或者汞灯(546nm)下则约75％。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯(647nm)下它们可被激发出98％的荧光，在氦氖灯下(633nm)为63％。Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。【藻红蛋白或藻胆色素蛋白-Phycoerythrin(PE)荧光标记二抗】存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。【AminomethylcoumarinAcetate(AMCA)】耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。注：由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X(RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明(TRITC)或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。西美杰备有全面的二抗现货产品并能提供最完整的二抗产品线。主要二抗品牌为全球最大的二抗和底物生产厂商KPL以及前沿抗体生产商ProteinTech。针对荧光标记二抗，有FITC、TRITC、Rhodamine、PE、Cy3/5、AMCA、Dylight等多种荧光标记二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG(Fc)、IgG(ab’)2等不同类型抗体。Theroleoffiltersinepi-fluorescencemicroscopy在激发波长在Ex范围内才能被激发，只有发射光波长大于BA/EM才能被观察到，背景光的波长只有大于DM才能被观察到。AsshowninFigure1,filterblocksareconstructedfrom2typesoffiltersand1dichroicmirror.Selectingappropriatefiltersandmirrorsforeachuseallowsresearcherstoattainahighsignaltonoise(S/N)ratiobetweenthefluorescenceandbackgroundlight.Thefunctionsoftheseopticalelementsaredescribedbelow.荧光滤色块组示意图。每个滤色块组有一个半透半反镜，一个激发光滤光片，两个发射光滤光片。如前面介绍的，由光源发出的光透过激发光滤光片进入滤色块组，被半透半反镜反射；发射出的荧光透过发射光滤光片进入目镜或相机。在这一组合中，半透半反镜以及左侧的发射光滤光片是固定在架子上的，而右侧的发射光滤光片则安装在一个可以拆卸的滤片框内。只要松动螺丝，就可以拆下右侧的滤片框，然后根据需要，更换半透半反镜。更换时需要注意，不要把固定用的胶水，涂到半透半反镜上，操作要带手套，避免将指纹留在镜面上。上述体视镜可搭配3各荧光滤色块，以及一个用于明场观察的无滤片块。观察时，可通过拉动杠杆调节滤色块的位置，每一个滤色块配有不同的标识，便于选择。Excitationfilter(EX)——激发光Theexcitationfilteristheopticalelementthatpassesonlythewavelengthoflightnecessaryforexcitationfromtheexcitationlightsource(usuallyamercurylamp)tothefluorophore.AsshowninFigure2,onlytheexcitationwavelengthpassesthroughthefilter,usuallyabandpassfilter.Dichroicmirror(DM)Thedichroicmirroristheopticalelementthatseparatestheexcitationlightfromthefluorescence.Dichroicmirrorsarespecialmirrorsthatreflectonlyaspecificwavelengthoflight,allowingallotherwavelengthstopassthrough(Figure3).Dichroicmirrorsusedinepi-fluorescencemicroscopefilterblocksareplacedina45°incidenceangletolight,creatingastopbandofreflectedlightandapassbandoftransmittedlight.Lightpassingthroughtheexcitationfilterisreflected90°towardtheobjectiveandthespecimen.Finally,lightemanatingfromthespecimenispassedthroughanddirectedtowardtheobserver(orhigh-sensitivitycamera).Barrierfilters(BA)oremission(EM)filtersBarrierfiltersareopticalelementsthatseparatefluorescenceemanatingfromthefluorophorefromotherbackgroundlight.AsshowninFigure4,thebarrierfiltertransmitslightofthefluorescencewavelengthwhichpassesthroughthedichroicmirrorwhileblockingallotherlightleakingfromtheexcitationlamp(reflectedfromthespecimenoropticalelements).Thisisnecessarybecausethestrengthofthefluorescentlightisweakerthantheexcitationlightbyafactorofmorethan100,000:1.Mostbarrierfiltersarepositionedataslightangletoallowbetterfluorescentimagingbysuppressingghostimages.Nikon'snoiseterminatorNikon'sepi-fluorescencemicroscopeshaveaproprietaryNikonopticalelementcalledanoiseterminator(onmodelsTE2000andlater).AsshowninFigure1,thenoiseterminatorallowsefficientprocessingoflighttransmittedthroughthedichroicmirrorbypreventingtheexcitationlightfromscatteringwithinthefilterblockandleakingintotheobservedimage.Thishelpstoeliminatebackgroundlightnoiseandmoreeffectivefluorescentimages.