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第二节分子生物学技术学习导航明目标、知重点难点尝试PCR(多聚酶链式反应)技术的基本操作。(重、难点)体验PCR这一常规分子生物学实验方法。(难点)理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。(重点)[学生用书P56])一、阅读教材P83分析使用PCR仪的安全措施1．严禁在PCR仪运行过程中打开池盖，否则会造成仪器的永久损坏。2．仪器运行时，样品池及池盖内表面温度较高，当心灼伤。3．仪器运行时，加热器内腔为高温、高压环境，严禁触及。4．仪器运行过程中如果发出尖锐的刺刮声音，请立刻停止运行，检查是否有微量离心管断裂等故障。5．仪器运行过程中如果没有反应，请切断电源，进行检查。6．必须保持样品池内部的清洁，可用蘸有体积分数为95%的酒精棉签擦拭相关部位。7．仪器必须放置在PCR实验室里，操作者在操作的时候必须遵循PCR实验室的相关规定，做好穿防护服、戴防护手套等相关防护措施。8．当仪器接通电源后，打开外壳或移走部件可能会造成人员伤害，因此，在进行任何调整、替换、保养或维修之前，请切断所有的电源。二、阅读教材P84完成多聚酶链式反应程序1．物质准备：向离心管中加入模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。2．变性：在94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋为单链DNA。3．退火(复性)：反应体系的温度降至55℃，引物与单链DNA上的特定部位相互配对。4．延伸：反应体系的温度回升到72℃左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。三、阅读P85～87分析目的DNA片段的体外扩增与鉴定1．DNA片段的PCR扩增(1)准备器材：PCR仪、台式高速离心机、0.2mLPCR微量离心管等。(2)在0.2mLPCR微量离心管中加入5_μL_10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5μL，1_μL模板DNA，5_μL引物1和5μL引物2，29_μL双蒸水。(3)煮沸5_min之后冰浴2_min，低速离心，按照1单位/μL加入TaqDNA聚合酶。(4)扩增DNA片断的反应程序：将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在94_℃的条件下预热5min，再设置反应程序为：94_℃，30_s→55_℃，30_s→72_℃，1_min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为72_℃，1_min。(5)按照PCR仪器操作要求运行反应程序。2．DNA分子的测定(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的乙醛溶液)。将0.1mLB液加入10mLA液中，混匀。(2)条件：在沸水浴中加热。(3)现象：出现蓝色现象。判一判(1)DNA扩增的变性过程中需要DNA解旋酶的参与。(×)(2)DNA扩增退火过程中需要DNA聚合酶的参与。(×)(3)DNA延伸过程需要TaqDNA聚合酶的作用。(√)(4)所有PCR中使用的引物都是相同的。(×)连一连多聚酶链式反应[学生用书P57]多聚酶链式反应技术又叫PCR技术。通过PCR技术就可以在体外对DNA的特定片段进行快速的复制，并获得大量的目的基因。结合教材P84内容完成以下探究。探究1结合图示理解PCR反应的过程及结果(1)PCR反应过程①变性：当温度上升到94℃左右时，双链DNA解旋为单链(如图)。②退火：系统温度下降至55℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(如下图)。③延伸：当系统温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链(如图)。(2)结果①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。探究2结合教材，推算PCR扩增数目的理论值理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有2n个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m×2n个DNA。讨论解旋酶、DNA聚合酶与DNA连接酶的作用？提示：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键；DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。PCR体外扩增DNA与生物体内DNA复制的比较体内复制PCR反应不同点解旋在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开加热至94℃左右，双链全部解开合成子链一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在72℃左右特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增DNA聚合酶需要需要TaqDNA聚合酶循环次数受生物体自身控制30次温度体内温和条件高温(可变)产物完整DNADNA片段相同点①需提供DNA复制的模板；②以四种脱氧核苷酸为原料；③都需要一定的缓冲溶液突破1PCR过程与细胞内的DNA复制过程区别1．如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反应过程的条件中相同的是()A．模板B．原料C．酶D．能量供应解析：选B。选项A模板不同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选项C酶不相同，胞内DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的TaqDNA聚合酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而PCR扩增主要由外界供能。突破2PCR扩增的过程2．近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。据此回答下列问题：(1)加热使DNA双链间的________键完全打开，称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。(3)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94℃左右)、退火(40～60℃)、延伸(72℃左右)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。(3)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。答案：(1)氢变性解旋(2)两(3)1/8PCR扩增原理的有关拓展(1)DNA热变性：双链DNA变性DNA。(2)理论上DNA扩增呈指数增长，实验值要略小于理论值。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段序列呈指数扩增。目的DNA片段的体外扩增与测定[学生用书P58]目的DNA片段的PCR扩增是在PCR仪中进行。结合教材P85～87内容完成以下探究。探究1完善下列步骤，学会目的DNA片段的体外扩增的操作过程准备材料：离心机、离心管、PCR仪、缓冲液、引物、原料等移液：用自动取液器按照配方在微量离心管中依次加入各成分离心：煮沸、冰浴处理，低速离心使溶液集中于管底扩增：将离心管放入PCR仪上，按照94℃、30s→55℃、30s→72℃、1min（以上过程循环30次）→72℃、1min的程序运行探究2观察下图示意图，理解DNA复制过程由此可见，在PCR反应中，DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，所以DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。探究3结合教材，完成DNA分子的测定(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的乙醛溶液)。将0.1mLB液加入10mLA液中，混匀。(2)取一定量的扩增前和扩增后的溶液分别放入两支试管中，加入等量的二苯胺试剂，混匀后观察溶液的颜色。用沸水浴加热上述溶液。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化。(3)根据蓝色的深浅，可以粗略地比较扩增前和扩增后溶液中DNA的含量是否有变化。(1)试概括PCR技术原理。提示：在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。PCR技术利用了DNA的热变性原理。(2)如何判断DNA片段的扩增是否成功？提示：既可用二苯胺试剂来粗略的比较扩增前和扩增后DNA含量的变化，也可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。1．DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为20～30个核苷酸。2．当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到55℃左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：①模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合；②引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会；③加入的引物的量足够大，而模板链数量少。3．实验操作的注意事项(1)PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。(2)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头必须更换。(4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。(5)PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。突破1PCR实验操作1．PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是()A．反复洗涤B．用酒精擦洗C．高压灭菌D．在－20℃储存解析：选C。为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。突破2DNA分子的测定2．在DNA鉴定过程中加入的试剂是()A．双缩脲试剂B．斐林试剂C．二苯胺试剂D．甲基绿解析：选C。双缩脲试剂鉴定蛋白质生成紫色，A错误；斐林试剂鉴定还原性糖生成砖红色，B错误；二苯胺试剂鉴定DNA生成蓝色，C正确；甲基绿鉴定细胞中DNA的分布，生成绿色，D错误。核心知识小结[网络构建][关键语句]多聚酶链式反应，简称PCR，是一种在体外快速扩增目的基．．．．．．．因或．．DNA．．．序列．．的技术。PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染，且向离心管中加入模板．．．．DNA．．．、引物和．．．．4．种脱氧．．．核苷酸以及．．．．．Taq．．．DNA．．．聚合酶。．．．．变性是在94℃．．．高温下使模板双链DNA解旋。退火是将反应体系温度降至55℃．．．，使引物与模板DNA链配对。延伸是将反应体系温度回升至72℃．．．左右，在Taq．．．DNA．．．聚合酶．．．作用下，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。DNA分子的测定：DNA分子＋二苯胺试剂．．．．．――→水浴加热蓝色物质．．．．。[随堂检测][学生用书P59]知识点一多聚酶链式反应程