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第二节基因工程的原理和技术1．简述基因工程的原理。2.描述基因工程基本操作的几个步骤。(重点)一、基因工程的基本要素多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等。二、基因工程的基本操作步骤1．获得目的基因(1)目的基因：人们所需要的基因。如：人的胰岛素基因、植物的抗病基因等。(2)获取方法①如果目的基因的序列是已知的，可用化学方法合成目的基因，或者用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因。②如果目的基因的核苷酸序列是未知的，可以从基因文库中获取。2．形成重组DNA分子通常是用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA(如质粒)，使其产生相同的粘性末端，然后用DNA连接酶将两者连接在一起，形成重组DNA分子。1．基因工程中的DNA重组与减数分裂过程中的DNA重组完全相同吗？提示：不完全相同。前者属于无性重组，可发生在不同种生物间，后者属于有性重组，发生在产生配子的过程中。3．将重组DNA分子导入受体细胞(1)常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。(2)导入方法举例：用质粒作为载体，宿主细胞应该选择大肠杆菌，用氯化钙处理大肠杆菌，增加其细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞。4．筛选含有目的基因的受体细胞(1)筛选原因：不是所有细胞都接纳了重组DNA分子。(2)筛选方法举例：由于质粒上有抗生素抗性基因，如四环素的抗性基因，含有这种重组质粒的受体细胞能够在有四环素的培养基中生长，而没有接纳重组DNA分子的细胞则不能在这种培养基上生长。这样就能筛选到含有重组DNA分子的受体细胞。经过培养，目的基因能够和质粒一起在宿主细胞内大量扩增。5．目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达，产生人们需要的功能物质。2．在基因工程的操作步骤中，都发生碱基互补配对。对吗？提示：不对。“重组DNA分子导入受体细胞”过程中不发生。基因、基因文库和目的基因1．基因：是有遗传效应的DNA片段(以DNA为遗传物质的生物)，是控制生物性状的遗传物质的基本结构和功能单位，基因的脱氧核苷酸序列代表遗传信息。2．基因文库(1)含义：是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。(2)目的：获得大量的目的基因。3．目的基因：是基因工程操作中需要的外源基因，它是编码某种蛋白质的结构基因，如生物的抗逆性基因、抗虫基因等。下列有关获取目的基因的方法的叙述，错误的是()A．直接分离目的基因的方法的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性B．由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法C．目前人工合成基因的方法主要有两种，分别是反转录法和化学合成法D．PCR技术的原理是DNA复制，需要RNA聚合酶催化DNA合成[解析]PCR技术的原理是DNA分子的复制，需要耐高温的TaqDNA聚合酶催化DNA合成，并以脱氧核苷酸等为原料。[答案]D[思维升华](1)供体细胞――→提取mRNA――→逆转录单链DNA――→合成双链DNA(目的基因)。此方法属于哪一种方法？提示：化学合成法。(2)短时间内获取大量目的基因需采用哪种方法？提示：PCR技术。DNA复制与PCR技术的比较DNA复制PCR技术场所细胞核内生物体外原理碱基互补配对碱基互补配对酶DNA聚合酶、解旋酶热稳定DNA聚合酶(Taq酶)续表DNA复制PCR技术条件模板、ATP、引物、常温模板、ATP、引物、温度变化(90℃～95℃→55℃～60℃→70℃～75℃)原料四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸特点形成的是整个DNA分子，一个细胞周期只复制一次短时间内形成大量DNA片段(目的基因)如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是()A．三种方法都需要酶并均在体外进行B．①②③碱基对的排列顺序均相同C．三种方法均属于人工合成法D．方法a不遵循中心法则解析：选A。这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制性核酸内切酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C错误；方法a遵循中心法则，D错误。认清基因组文库法与逆转录法获取目的基因的不同(1)酶：前者需要限制酶；后者需要逆转录酶。(2)原料：前者不需要原料；后者需要脱氧核苷酸。(3)结构：前者基因中含有启动子，能转录；后者基因中没有启动子，只将编码序列导入受体细胞，故无法进行转录。重组DNA分子的形成及其导入受体细胞1．形成重组DNA分子(1)目的：基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)方法①通常用同一种限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA(如质粒)，形成相同的粘性末端。②用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。如下图：2．将重组DNA分子导入受体细胞选择的关键是分析基因工程的最终目的，按转基因的目的来选择：基因工程的最终目的常用的受体细胞导入的方法得到大量特殊蛋白质大肠杆菌等微生物Ca2＋处理法得到转基因动物受精卵显微注射法得到转基因植物植物体细胞农杆菌转化法常选细菌作受体细胞的原因：它们繁殖力极强，生长速度很快，短期内就会产生大量后代，所以把目的基因转入这些细菌，就能在短时间内得到大量的目的基因产物。下列关于基因工程的叙述中，正确的是()A．基因工程利用的原理是基因突变B．细菌质粒是基因工程常用的载体C．通常用一种限制性核酸内切酶处理目的基因的DNA，用另一种限制性核酸内切酶处理载体DNAD．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体[解析]基因工程利用了基因重组的原理；为了获得相同的粘性末端，常用同一种限制性核酸内切酶切割载体和目的基因；培育转基因植物的受体细胞可以是体细胞，也可以是受精卵。[答案]B[思维升华](1)重组DNA分子导入受体细胞发生碱基互补配对吗？提示：不发生。(2)目的基因能直接进入受体细胞吗？提示：目的基因由于具有大分子性，不能单独进入受体细胞，必须由载体携带进入。用同一种限制性核酸内切酶(单酶切)分别切割目的基因与运载体是最简单的一种方法，但连接后会出现两种不需要的连接产物：目的基因—目的基因(环状)连接物、质粒—质粒(环状)连接物，加大了筛选的工作量。所以可用两种不同限制性核酸内切酶(双酶切)分别同时切割含目的基因的DNA片段和质粒，这样可以防止目的基因与质粒自身连接体的产生，克服单酶切的缺点。基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是生物工程的一个重要分支。基因表达载体的构建(即目的基因与载体结合)是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。以下有关说法正确的是()A．限制性核酸内切酶的功能是切割各种DNA分子B．基因工程中经常用到的酶只有DNA连接酶和限制性核酸内切酶C．将目的基因与载体结合的过程，实际上就是不同来源的DNA重新组合的过程D．具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处，先形成磷酸二酯键，再形成氢键解析：选C。限制性核酸内切酶的作用是切割外来的DNA，自身DNA由于受到保护而不会被切割。基因工程常用的酶除了DNA连接酶和限制性核酸内切酶，还有DNA聚合酶(合成DNA片段)、逆转录酶(用mRNA逆转录生成DNA)等多种酶。基因表达载体的构建时先用一定的限制性核酸内切酶切割载体(如质粒)，使质粒出现一个缺口，露出粘性末端；然后用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因，使其产生相同的粘性末端(部分限制性核酸内切酶可切割出平末端，具有相同效果)；将切下具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处，首先是碱基互补配对结合，两个粘性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再在DNA连接酶的作用下，催化两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，形成一个重组DNA分子。含有目的基因的受体细胞的筛选及目的基因的表达与检测1．筛选含有目的基因的受体细胞(1)原理：质粒上有标记基因(如抗生素抗性基因)。(2)方法：利用选择培养基筛选。(3)举例2．目的基因的表达与检测(1)目的基因表达的标志看到目的性状或分离得到目的基因表达产物。(2)目的基因表达的检测①检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。②个体生物学水平的鉴定：如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。目的基因在受体细胞中的存在与表达是有区别的。目的基因被受体细胞摄取是表达的前提，但是被摄取并不意味着被表达。由于各种因素的影响，还需要采取一定的措施去促使目的基因的表达。质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因如下图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同。下表是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()细菌在含氨苄青霉素培养基上的生长情况细菌在含四环素培养基上的生长情况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长A．①是c；②是b；③是aB．①是a和b；②是a；③是bC．①是a和b；②是b；③是aD．①是c；②是a；③是b[解析]外源基因插入a点后，抗氨苄青霉素基因被破坏，抗四环素基因还保留，所以是③；外源基因插入b点后，抗氨苄青霉素基因还是完整的，抗四环素基因被破坏，所以是②；外源基因插入c点后，抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因均完整，所以是①。[答案]ADNA探针是利用放射性同位素等标记的特定DNA片段。当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时，形成标记DNA—DNA(或标记DNA—RNA)的双链杂交分子，可检测杂交反应结果。用某人的胰岛素基因制成DNA探针，能与之形成杂交分子的是()①该人胰岛A细胞中的DNA②该人胰岛B细胞中的mRNA③该人胰岛A细胞中的mRNA④该人肝细胞中的DNAA．①③④B．①②③C．①②④D．②③④解析：选C。DNA单链能与其互补链及其转录产生的mRNA分子互补配对而形成杂交分子；人体细胞中都有胰岛素基因，但此基因只有在胰岛B细胞中才能得到表达。[随堂检测]1．下列关于基因工程技术的叙述，正确的是()A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达解析：选D。A项，限制性核酸内切酶大多特异性地识别6个核苷酸序列，但也有少数限制性核酸内切酶能识别4个、5个或8个核苷酸序列。B项，PCR反应中温度周期性变化是为变性、复性和延伸创造条件。另外，耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用，变性和复性过程不需要酶的催化。C项，载体质粒上的抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，而不是抗生素合成基因。D项，目的基因导入受体细胞后不一定能正常表达。2．将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是()A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子解析：选C。大肠杆菌成功表达出腺苷酸脱氨酶，说明这些大肠杆菌都至少含有一个重组质粒，A项正确；作为载体的条件为至少含有一个或多个酶切位点，所以作为载体的质粒至少含有一个限制性核酸内切酶识别位点，B项正确；作为基因表达载体应包括目的基因、启动子、终止子、标记基因四部分，但并不是每个酶切位点都至少插入一个