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第2课时基因工程的实施过程学习导航明目标、知重点难点简述基因工程的一般过程。(重点)理解基因工程每个步骤的原理、方法和过程。(重、难点)阅读教材P13～18完成基因工程的实施相关问题基因工程涉及多种技术操作，主要包括获取目的基因，构建基因表达载体，将目的基因导入受体细胞，以及目的基因的检测和鉴定等步骤。1．获取目的基因(1)通过基因文库获取目的基因。(2)通过PCR技术扩增目的基因。(3)通过化学方法直接人工合成目的基因。2．构建基因表达载体(1)是实施基因工程的核心步骤，其操作过程是将目的基因与质粒、λ噬菌体或一些动植物病毒等在体外进行重组。(2)一个基因表达载体除了目的基因外，还应包括启动子、终止子和标记基因等。(3)启动子是位于目的基因上游的一段核苷酸序列，是RNA聚合酶识别、结合的部位。(4)终止子是一段特殊的DNA片段，是载体上终止目的基因转录的核苷酸序列。3．导入目的基因(1)将基因表达载体导入受体细胞是实施基因工程的重要步骤。(2)将目的基因导入植物细胞的常用方法——农杆菌转化法。(3)将目的基因导入动物细胞的常用方法——显微注射法。(4)将目的基因导入微生物细胞的方法——转化法，用Ca2＋处理，使大肠杆菌等成为一种能够吸收周围环境中DNA分子的感受态细胞。4．检测和鉴定目的基因用DNA分子杂交法进行DNA水平和RNA水平检测，采用抗原—抗体杂交从蛋白质水平检测，有时还需要从个体水平对其生物学特定性状进行检测。判一判(1)所有的目的基因都可从基因文库中直接获得。(×)(2)标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。(√)(3)启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。(√)(4)抗虫或抗病的接种实验属于分子水平的检测。(×)连一连目的基因的获取与基因表达载体的构建基因工程涉及多种技术操作，首先需要获取目的基因，构建基因表达载体。结合教材P13～15第六段内容完成以下探究。探究1完善下面基因工程的操作示意图，概述基因工程的一般步骤由图分析基因工程的“施工”过程主要包括获取目的基因、构建基因表达载体、将目的基因导入受体细胞及目的基因的检测和鉴定。探究2结合教材完成下面问题，理解目的基因的获取(1)通过基因文库获取目的基因①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌可能分别含有该种生物的不同基因，称为基因文库。②种类：基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库（如cDNA文库）：含有一种生物的部分基因③目的基因的获取根据基因的有关信息：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等信息，就可以直接从基因文库中获取目的基因。(2)完善如图关于PCR技术的过程，分析PCR技术扩增目的基因的方法。(3)人工合成法：若基因较小、核苷酸序列已知，可以人工合成。探究3完善下图，构建基因表达载体(1)观察下图(以质粒作为载体)，并完成其基本过程：(2)完善下面基因表达载体模式图，并分析表达载体的组成及重要构件的作用。1．提取目的基因的方法(1)基因组文库供体细胞中的DNA――→限制酶许多DNA片段――→连接表达载体――→导入受体细胞――――――――――――→外源DNA扩增，产生特定性状分离目的基因(2)cDNA文库供体生物―→mRNA―→cDNA―→受体菌群―→目的基因(3)PCR技术目的基因―→单链DNA―→双链DNA―→大量目的基因(4)人工合成蛋白质的氨基酸序列―→mRNA核苷酸序列―→DNA核苷酸序列―→目的基因2.突破1目的基因的获取1．如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是()A．这三种方法都用到酶，都是在体外进行B．①②③碱基对的排列顺序均相同C．图示a、b、c三种方法均属人工合成法D．方法a不遵循中心法则解析：选A。分析题图可知a为逆转录法获得目的基因，用到逆转录酶；b为直接从生物体获得目的基因，用到限制酶；c为用PCR技术扩增获取目的基因，用到TaqDNA聚合酶，且三种方法均在生物体外进行，故A正确；图示中①为逆转录法，②为直接分离目的基因，③为PCR技术扩增法，由于密码子的简并性，三种方法得到的目的基因中碱基对排列顺序不一定相同，故B、C错误；逆转录法遵循中心法则的内容，故D错误。获取目的基因的四种方法比较方法基因文库的构建PCR技术扩增人工合成基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)优点操作简单专一性强可在短时间内大扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较烦琐，技术要求过高需要严格控制温度，技术要求高适用范围小突破2基因表达载体的构建2．如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是()A．图示过程是基因工程的核心步骤B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠC．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构解析：选B。图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等。启动子≠起始密码(子)；终止子≠终止密码(子)(1)启动子和终止子都在DNA上，在遗传信息转录时起作用。启动子是启动转录的开始，终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位都是脱氧核苷酸。(2)起始密码子和终止密码子都是mRNA上三个相邻碱基。起始密码子决定翻译的开始，终止密码子决定翻译的停止。将目的基因导入受体细胞[学生用书P8]受体细胞不同，基因工程的“导入”步骤也不完全相同。结合教材P15第七段～P17第二段内容探究目的基因导入受体细胞的方法。(1)目的基因导入植物体细胞最常用的方法是农杆菌转化法。①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染力；当双子叶植物或裸子植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中Ti质粒的TDNA可进入受体细胞，并整合到受体细胞的染色体上。②完善抗软化番茄的培育原理，总结将目的基因导入植物细胞的过程目的基因插入Ti质粒的TDNA――→进入农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到植物细胞染色体上→目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达。(2)目的基因导入动物细胞常用方法是显微注射法：目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物。(3)目的基因导入微生物细胞常用方法是Ca2＋处理法。①受体细胞是微生物细胞，其特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等；②转化过程是Ca2＋处理细胞→感受态细胞→感受态细胞和重组的基因表达载体混合于缓冲液中→感受态细胞吸收DNA分子。(1)目的基因能否在受体细胞中稳定遗传？提示：若是目的基因插入到受体细胞染色体上的DNA分子中，则能稳定遗传；若是目的基因在细胞质中，而细胞分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因，则不一定稳定遗传。(2)农杆菌转化法中有两次拼接和两次导入。两次拼接的方式和导入的目的都一样吗？提示：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的TDNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的TDNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的TDNA导入受体细胞。1．农杆菌转化法分析(1)构建携带目的基因的表达载体，需要两种工具酶：限制酶和DNA连接酶。(2)基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。(3)由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到植物组织培养技术。2．将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞是受精卵，不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。3．在基因工程四个步骤中，只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对。突破1将目的基因导入动植细胞1．基因工程操作中将DNA导入受体细胞称为转化。下列相关叙述不正确的是()A．被转化的细胞吸收外源DNA是转化的实质B．农杆菌转化法适用于所有的植物C．动物细胞相对于植物细胞吸收DNA的障碍要小D．显微注射法一般用于动物细胞的转化解析：选B。农杆菌转化法只适用于双子叶植物或裸子植物。突破2将目的基因导入微生物细胞2．基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因主要是()A．结构简单，操作方便B．繁殖速度快C．遗传物质含量少、简单D．性状稳定，变异少解析：选B。目的基因导入受体细胞后，随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌等微生物繁殖速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。因此，基因工程常用的受体细胞有细菌、真菌等。(1)原核生物繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，有利于目的基因的复制与表达，因此常采用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。(2)植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。检测与鉴定目的基因[学生用书P9]基因表达载体导入受体细胞后，并不是所有细胞都能按照预先设定的有效表达，需要对其检测和鉴定。结合教材P17最后两段～P18内容完成以下探究。探究1观察下图，分析DNA水平检测(1)由上图可知，DNA分子杂交法的基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链，在一定条件下(适宜的温度等)按照碱基互补配对原则形成双链。杂交过程是高度特异性的，杂交的双方是待测的DNA和用放射性同位素标记的已知DNA片段(又称基因探针)。若待测核酸中有能与探针互补的特异DNA片段，用于示踪的放射性同位素标记将指示其所在的位置，表明目的基因已插入到转基因生物染色体的DNA中。(2)同理利用DNA和mRNA之间杂交技术，检测目的基因是否转录出mRNA。(3)蛋白质水平检测：先从待测转基因生物中提取蛋白质，再利用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，若出现杂交带，说明目的基因已表达出相应的蛋白质。探究2个体水平检测检测指标是检测目的基因所控制的性状。如检测抗虫植物的方法是害虫食用抗虫植株，观察目标是害虫死亡。分子水平和个体水平上检测和鉴定方法的比较类型步骤检测内容方法结果显示分子检测导入检测目的基因是否导入受体细胞DNA分子杂交技术(DNA和DNA之间)是否成功显示出杂交带表达检测目的基因是否转录出mRNA核酸分子杂交技术(DNA和mRNA之间)是否成功显示出杂交带目的基因是否翻译出蛋白质蛋白质分子杂交(抗原和抗体之间)是否成功显示出杂交带个体生物学水平的鉴定①确定是否具有抗性及抗性程度；②基因工程产品与天然产品的活性是否相同①抗虫或抗病的接种实验；②基因工程产品与天然产品活性的比较是否赋予了预期抗性或蛋白质活性c突破1分子水平的鉴定1．转基因抗虫棉培育过程中要对Bt基因导入受体细胞后是否可以稳定维持和表达进行检测与鉴定，其中利用到碱基互补配对原则的有()①检测棉花的DNA上是否插入了Bt基因②检测Bt基因是否在棉花细胞转录出mRNA③检测Bt基因是否在棉花细胞翻译成蛋白质④检测Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性A．①②B．①③C．②③D．②④解析：选A。检测棉花的DNA上是否插入了Bt基因和检测Bt基因是否在棉花细胞转录出mRNA都是用标记的目的基因作探针进行分子杂交，因此都要进行碱基互补配对；检测Bt基因是否在棉花细胞中翻译成蛋白质需进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性需要做抗虫接种实验，这两项技术都没有涉及碱基互补配对原则。突破2个体水平上鉴定2．下列