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第二节分离特定的微生物并测定其数量学习导航明目标、知重点难点了解、分析选择分离微生物的条件。(重点)简述选择分离微生物并进行计数的方法。(重、难点)学会从土壤中分离出能分解纤维素的微生物的方法。(重点)[学生用书P14])一、阅读教材P17～18分析微生物的分离1．原理：在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离出某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成的单个菌落，即为纯培养物。2．方法：平板分离法，包括涂布平板法和混合平板法。3．选择培养分离：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合某种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离。4．根据菌落特征初步分离(1)菌落的含义：是指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。(2)菌落特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。二、阅读教材P19～22完成土壤微生物的分离、培养与数量测定1．涂布平板法培养和计数土壤微生物(1)准备实验器材：所有玻璃器皿灭菌前需要用适当浓度的浓硫酸浸泡24h。(2)采集土壤，制备悬液①制备悬液：称取0.5g土壤样品，倒入盛有50mL无菌水的锥形瓶，振荡20min，使土样充分打散，即为10－2g/mL的土壤悬液。②等比稀释：用无菌移液管吸取0.5mL土壤悬液注入盛有4.5mL无菌水的1号试管，配成10－3g/mL的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸1号试管3次，使悬液均匀，再吸取0.5mL注入盛有4.5mL无菌水的2号试管，配成10－4g/mL的土壤悬液。以此类推，依次配制成10－5g/mL、10－6g/mL、10－7g/mL、10－8g/mL的土壤悬液。(3)选择适于分离特定微生物的培养基：利用不同微生物代谢特性的不同，通过选择培养基选出所需要的特定微生物。(4)接种：用3支无菌移液管分别吸取10－8g/mL、10－7g/mL、10－6g/mL的土壤悬液各1mL加入培养皿中，每个浓度设置3个重复，并充分振荡混合均匀，用涂布平板法进行分离。(5)培养与观察：将培养皿倒置于37_℃恒温箱中培养1～2d，观察细菌菌落。(6)计数菌落：培养1～2d后取出平板，计数，选取菌落数为30～300的一组为样本进行统计。每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(假定涂布所用稀释液为1mL)。2．显微镜直接计数法(1)原理：此法利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。血球计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1mm2和高0.1mm的计数室，在1mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。(2)操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌毛细吸管吸取摇匀的土壤微生物培养液，在盖玻片边缘滴一小滴，让培养液通过毛细渗透作用自动进入计数室。然后在显微镜下计数4或5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数。三、阅读教材P22～23完成分离土壤中能分解纤维素的微生物1．实验原理：纤维素分解菌可以分泌纤维素酶，在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，其他微生物则不能生长。2．筛选方法：刚果红染色法。如果发现菌落周围出现透明圈，则这些菌落就是能分解纤维素的细菌形成的。判一判(1)菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。(√)(2)稀释涂布平板法的结果都可在培养基表面形成单个的菌落。(×)(3)每种培养基都只适合一种微生物的特殊营养需求。(×)(4)在固体培养基上形成的单个菌落即为纯培养物。(√)(5)富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，反之则多。(×)连一连平板分离法分离微生物[学生用书P15]利用选择培养基可达到分离纯化微生物的目的，常用平板分离法分离和纯化微生物。结合教材P17内容完成以下探究。据图比较两种分离和纯化方法。比较操作特点结果涂布平板法取一定稀释度的样品涂布平板↓用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀先制作平板后加入菌液细菌菌落通常仅在平板表面生长混合平板法取一定稀释度的样品与熔化的培养基混合↓将与样品混合后的培养基倒入无菌培养皿菌液与培养基混合，共同倒平板细菌菌落出现在平板表面及内部1．选择培养基(1)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制和阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。(2)选择培养基的不同处理方法①在培养基全部营养成分具备的前提下，加入某种物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。②通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。③利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。④通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。2．平板划线法和涂布平板法的区别比较优点缺点适用范围平板划线法可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数适用于好氧菌涂布平板法可以计数，可以观察菌落特征吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延适用于厌氧菌和兼性厌氧菌突破1选择培养基1．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需要的微生物。在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素，可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%的酚，可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分离出()A．大肠杆菌B．霉菌C．放线菌D．圆褐固氮菌解析：选A。固氮细菌的生长不需要从培养基中获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长，因此可分离出圆褐固氮菌；在加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放线菌，可分离出霉菌；在加入10%的酚的培养基中，因该培养基能抑制细菌和霉菌的生长，所以可分离出放线菌。利用上述三种培养基无法分离出大肠杆菌。生物的适应性是选择培养基配制的理论依据生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基，控制培养条件等可以选择目的微生物，如将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。突破2涂布平板法2．下列有关稀释涂布平板法的叙述，错误的是()A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释B．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C．适宜条件下培养D．结果都可在培养基表面形成单个的菌落解析：选D。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。突破3平板划线法和涂布平板法3．用平板划线法或涂布平板法纯化大肠杆菌时()①可以用相同的培养基②都需要使用接种针进行接种③都需要在酒精灯火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌A．①②B．③④C．①③D．②④解析：选C。平板划线法或涂布平板法都使用固体培养基，故①正确；平板划线法采用接种针进行操作，而稀释涂布平板法采用玻璃涂布器进行操作，故②错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故③正确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故④错误。辨明平板划线法与涂布平板法操作中的易误区平板划线法中的主要操作要领是“多次划线”，稀释涂布平板法中的主要操作要领是“充分稀释”，二者虽然操作方法不同，但目的是一样的，即获得由单个细胞增殖而成的菌落。如果平板划线法中的划线次数太少或稀释涂布平板法中的稀释倍数不够，则得到的菌落可能是由多个细胞增殖而来的，其中可能掺杂着其他杂菌，达不到纯化的目的。微生物的计数方法[学生用书P16]利用特定血球计数板，可在显微镜下直接计算一定容积的样品中微生物数量，但不能区分细菌的死活。常用涂布平板法计数避免其不足。结合教材P20～22内容完成以下探究。探究1结合下图(以土壤微生物为例)，分析用涂布平板法计数微生物的方法(1)计数原理：将待测样品经过适当稀释后，其中的微生物可能被分散成单个个体，吸取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养会形成由单个细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，每个菌落代表原样液中的一个微生物。(2)基本步骤：采集土壤，制备土壤悬液→选择适于分离特定微生物的培养基→接种→培养与观察→计数菌落。(3)设置重复组的目的是增强实验的说服力与准确性。(4)培养与观察时应将培养皿倒置于37℃恒温箱中培养1～2d，观察细菌菌落。(5)计数菌落①培养24～48h后取出平板计数，选取菌落数为30～300的一组为样本进行统计。②每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(假定涂布所用稀释液为1mL)。探究2结合下图，分析显微镜直接计数法(1)操作过程①将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物悬液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液沿着缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。②加样后静置5min，然后在显微镜下计数4或5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的菌体总数。(2)换算公式：1mL悬液所含菌体总数＝每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数。(1)涂布平板法统计的菌落数就是活菌的实际数目，对吗？提示：不对，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。(2)直接计数法统计的菌落数就是活菌数吗？提示：不是，直接计数法统计的死菌、活菌都计算在内，所以统计的菌落数不仅仅是活菌数目。1．间接计数法(活菌计数法)(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。(2)操作①设置重复组：同一稀释度下，至少涂3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果明显不一致，意味着操作有误，需要重新实验。②为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。③计算公式：每克样品中的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1mL)。④培养1～2d，统计每个培养皿中的菌落数。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落。2．直接计数法和间接计数法的比较直接计数法间接计数法主要用具显微镜、血球计数板培养基计数依据菌体本身培养基菌落数优点计数方便、操作简单计的是活菌数缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，且有一定误差计算公式每毫升悬液中菌体数＝400×104×每小格平均菌体数×稀释倍数每克样品中的细菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1mL)注：400、104是常数。突破1微生物间接计数1．金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起食物中毒、肺炎、肠炎等。某研究小组的同学用所学的微生物的实验室培养的方法进行“变质牛奶中金黄色葡萄球菌的分离和计数实验”，部分实验处理和结果如下图。(注：培养皿旁