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课时作业11多聚酶链式反应扩增DNA片段1．下列关于PCR的描述中，正确的是()①PCR是一种酶促反应②引物决定了扩增的特异性③扩增DNA利用了热变性的原理④扩增的对象是氨基酸序列A．①②④B．②③④C．①③④D．①②③答案：D2．用15N标记的一个DNA分子放在含14N培养基中复制三次，含15N的DNA分子占全部DNA分子比例和全部DNA单链的比例依次是()A．1/4，1/6B．1/4，1/8C．1/2，1/8D．1/2，1/4解析：DNA是半保留复制，复制一次形成两分子DNA，每分子DNA都含有一条15N和14N单链；复制两次，形成四个分子，含15N的只有两分子DNA；复制三次形成的八个DNA分子中含15N的仍是两分子。这时DNA单链有十六条，含15N的只有亲代的两条。答案：B3．在PCR扩增实验中，引物是很重要的。下列属于引物特点的是()①引物长度一般是80～100个碱基对(bp)为宜②引物的(G＋C)/(A＋T)含量一般为40%～60%③引物3′端不能有3个以上连续相同的碱基④引物自身不能含有互补序列A．①②B．③④C．①③D．②④解析：引物长度一般以20～30碱基对(bp)为宜，包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。引物太短或太长，都可能降低产物的特异性。引物的G＋C含量一般为40%～60%。碱基的分布是随机的。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶连续排列，尤其是引物3′端不能有3个以上连续相同的碱基。引物自身不能含有互补序列，否则会形成发夹二级结构。两个引物在3′端也不能出现同源性，避免形成引物二聚体。答案：B4．PCR的循环一般要经历三十多次，每次循环可以分为三步，其顺序是()A．变性、延伸、复性B．变性、复性、延伸C．复性、变性、延伸D．延伸、变性、复性解析：PCR循环的具体过程是：一、变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链；二、复性：温度缓慢下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；三、延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。因此，选B。答案：B5．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是()A．92℃、52℃、72℃B．72℃、50℃、92℃C．50℃、92℃、72℃D．80℃、50℃、72℃解析：当温度上升到90℃(90℃～96℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度缓慢下降到50℃(40℃～60℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度上升到72℃左右(70℃～75℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。答案：A6．下图是哪次循环的产物()A．第一次循环B．第二次循环C．第三次循环D．第四次循环解析：在PCR反应中，以引物为起点，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示：因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。答案：A7．下列操作过程的叙述中错误的是()A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换解析：为了防止外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性枪头。在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，不能迅速融化。答案：C8．关于PCR技术的应用，错误的一项是()A．古生物学、刑侦破案、DNA序列测定B．诊断遗传疾病、基因克隆、古生物学C．DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案D．诊断遗传疾病、合成核苷酸、DNA序列测定解析：PCR技术能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。这项技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题，被广泛应用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等各方面，而不能用于合成核苷酸。答案：D9．家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力。将人干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养，可提取干扰素用于制药。采用PCR技术可验证．．干扰素基因是否已经导入家蚕细胞。该PCR反应体系的主要成分应包含：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水、4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、__________和________。解析：PCR反应体系的主要成分包括：扩增缓冲液(含Mg2＋)、水，4种脱氧核糖核苷酸、模板DNA、TaqDNA聚合酶、两种引物。答案：对干扰素基因特异的DNA引物对TaqDNA聚合酶10．(2017年高考·江苏卷)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的________位点。设计引物时需要避免引物之间形成________，而造成引物自连。(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物)。解析：(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火(复性)，步骤3为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。答案：(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高(5)②③11．(2019年宝鸡质检)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份相同的DNA片段。请根据所学知识回答下列有关PCR技术的基本原理和应用问题。(1)PCR的原理是：在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，称为________。PCR利用了DNA的________原理，通过控制________来控制双链的解聚与结合。(2)为了解决高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成PCR技术的自动化，20世纪80年代，科学家从水生耐热细菌Taq中分离得到耐高温的________。实验室中微生物的筛选，是人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长，用于筛选目的菌株的培养基称为________。(3)PCR反应的条件：稳定的缓冲液环境、________、分别与两条模板链结合的两种________、四种________、耐热的DNA聚合酶、能严格控制温度变化的温控设备。(4)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为________、________和________三步。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为________参与反应。DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增，如果在PCR反应中只有一个DNA片段，在6次循环后，反应体系中共有________个这样的DNA分子。(5)简述目前PCR技术的具体应用(至少答两点)：________________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案：(1)复性热变性温度(2)TaqDNA聚合酶(或耐热性DNA聚合酶)选择培养基(3)DNA模板引物脱氧核苷酸(4)变性复性延伸模板64(5)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面(答对两点即可)12．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，此过程需要一种TaqDNA聚合酶。请回答有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用________。(2)TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的。①为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？________________________________________________________________________。②TaqDNA聚合酶的功能是________________________________________________________________________。③TaqDNA聚合酶的化学本质为蛋白质，可用________法和________法进行分离。(3)从土壤中分离分解尿素的细菌时，应采取的措施是________，原因是______________________。(4)相对于细菌分离，而DNA分子的分离和提取操作要复杂的多。①在DNA提取中两次用到蒸馏水，其目的分别是：________、________。②实验中能否以哺乳动物成熟的红细胞为实验材料？为什么？____________________________________________________________________________________________________________________________________。(5)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在________中才能进行，并且要严格控制________条件。(6)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是________。答案：(1)高温使DNA分子热变性(2)①热泉70℃～80℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物②催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键③凝胶色谱电泳(3)将细菌在培养基中培养，其中惟一的氮源是尿素只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长和繁殖(4)①使血细胞破裂，释放出DNA分子稀释NaCl溶液，使DNA分子析出②不能，哺乳动物成熟的红细胞中无DNA分子(5)一定的缓冲溶液温度(6)2作为DNA复制的起点13．请回答下面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如上图所示)。图中引物为单链DNA片段，它