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课题3分解纤维素的微生物的分离学习目标：1.了解纤维素与纤维素酶。2.理解纤维素分解菌的筛选原理。(重点)3.简述从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。1．纤维素与纤维素酶(1)纤维素①元素组成：C、H、O三种元素。②组成单体：葡萄糖。③种类：除天然纤维素外，还有水溶性的羧甲基纤维素钠、不溶于水的微晶纤维素等。(2)纤维素酶①组成：纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。②作用纤维素――――――→C1酶、CX酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖2．纤维素分解菌的筛选(1)方法刚果红染色法方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应方法二：在倒平板时就加入刚果红(2)原理：以纤维素分解菌3．实验设计和课题延伸(1)实验设计土壤取样：选择纤维素丰富的环境↓选择培养：通过选择培养来增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的菌株↓梯度稀释：目的是使菌体分离↓涂布培养：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上↓挑选菌株：挑选产生透明圈的菌落(2)课题延伸①为确定透明圈内的菌落是否是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。②纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。1．判断对错(1)纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。()(2)对分解纤维素的微生物进行了初步筛选后，无需再进行其他实验。()(3)纤维素酶的测定方法，一般是对所产生的葡萄糖进行定量的测定。()(4)纤维素酶是一种复合酶。()提示：(1)√(2)×初步筛选只是分离纯化的第一步，为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产生纤维素酶的实验。(3)√(4)√2．在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是()A．分解尿素的细菌B．硝化细菌C．分解纤维素的细菌D．乳酸菌C[分解纤维素的细菌能将纤维素分解，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。]3．筛选出纤维素分解菌后还需要用下列哪项实验来确定()A．发酵产纤维素酶B．发酵产纤维素C．纤维素酶分解滤纸D．纤维素分解产生葡萄糖A[为确定得到的透明圈中的菌落是否是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。]纤维素酶及纤维素分解菌的筛选[合作交流]1．草食性动物是怎样消化食物中的纤维素的？提示：反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。微生物能够产生纤维素酶，最终将纤维素分解成葡萄糖。2．培养基中出现透明圈一定是纤维素分解菌的作用吗？提示：不一定。刚果红与多糖类化合物产生红色复合物，若多糖为淀粉，产生淀粉酶的微生物也可使培养基产生透明圈。[归纳总结]1．纤维素酶(1)纤维素酶的组成及作用：(2)纤维素酶作用的实验验证试管12滤纸条1cm×6cm1cm×6cm缓冲液(pH＝4.8)10mL11mL纤维素酶(70～80u/mL)1mL－条件将试管固定在50mL的锥形瓶中，在摇床上以140r/min的转速振荡反应1h结果滤纸条被完全分解滤纸条基本无变化2.纤维素分解菌的筛选——刚果红染色法(1)原理：纤维素分解菌↓产生刚果红＋纤维素――→形成红色复合物――――→纤维素酶红色消失、出现透明圈，根据是否产生透明圈来筛选(2)染色方法：方法一：培养基经涂布培养长出菌落→覆盖质量浓度为1mg/mL的CR溶液――――――→10～15min后倒去CR溶液→加入物质的量浓度为1mol/L的NaCl溶液――――――→15min后倒掉NaCl溶液→出现透明圈。方法二：配制质量浓度为10mg/mL的CR溶液→灭菌→按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液→混匀→倒平板→接种后培养→出现透明圈。(3)两种刚果红染色法的比较：方法一方法二区别先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应倒平板时就加入刚果红优点显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作简便，不存在菌落混杂问题缺点操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂容易出现假阳性反应特别提醒：在倒平板时就加入刚果红容易出现假阳性反应的原因(1)由于在纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。(2)有些微生物具有降解色素的能力，长时间培养会降解刚果红，从而形成明显的透明圈，这些微生物与纤维素分解菌不易区分。[典题通关]下列关于分离纤维素分解菌的实验的叙述，错误的是()A．经选择培养后将样品直接涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B．选择培养这一步可省略，但培养出的纤维素分解菌少C．可先在固体培养基上培养微生物，再用刚果红溶液染色D．鉴别纤维素分解菌的原理是纤维素分解后的产物不能和染料形成红色复合物A[经选择培养后需要进行梯度稀释后方可涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上，A错误；选择培养这一步可以省略，但培养出的纤维素分解菌少，B正确；常用的刚果红染色法有两种：一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红，C正确；鉴别纤维素分解菌的原理是纤维素分解后的产物不能和刚果红形成红色复合物，D正确。]1．下列关于纤维素的叙述中，不正确的是()A．纤维素是由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物B．纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为这些微生物能够产生纤维素酶C．植物的根、茎、叶等器官中都含有大量的纤维素D．自然界中的各种生物均能把纤维素分解成葡萄糖，从而作为生物体的能量来源D[自然界中许多生物都不能分解纤维素。故选D。]2．纤维素分解菌的筛选原理是()A．刚果红可以与纤维素形成红色复合物B．刚果红可以与纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物C．刚果红可以与纤维素酶形成红色复合物D．刚果红可以与纤维素分解菌结合形成红色复合物A[刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和纤维素水解后产生的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，刚果红也不与纤维素酶或者与纤维素分解菌结合形成红色复合物。故正确答案为A。]分离纤维素分解菌的实验设计与分析[合作交流]1．为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？提示：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种环境中获得目的微生物的概率要高于普通环境。2．在纤维素分解菌的筛选过程中涉及的生物技术有哪些？提示：主要用到培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用和土壤取样等。[归纳总结]1．实验流程2．选择培养的操作步骤3．纤维素分解菌的筛选与鉴别所用的培养基的比较(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。纤维素分解菌的鉴别培养基为固体培养基，因为需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。(2)在上述选择培养基中能以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；而在上述鉴别培养基中，绝大多数微生物都可以正常生长。(3)选择培养基的目的是选择出某种微生物并通过培养增加数量，而鉴别培养基的目的是鉴别微生物种类。(4)在使用顺序上，一般先使用选择培养基培养，梯度稀释后再用鉴别培养基鉴别。[典题通关]废纸的主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源——乙醇。如图是工业上利用微生物由纤维素生产乙醇的基本工作流程，请回答相关问题：(1)自然界中①环节需要的微生物大多分布在____________的环境中。将从土壤中获得的微生物培养在以________为唯一碳源、并加入________的培养基上筛选周围有________的菌落。(2)如上所述的筛选中获得了三个菌落，对它们分别培养，并完成环节②，且三种等量酶液中酶蛋白浓度相同，则你认为三种酶液的活性____________(填“一定相同”“不一定相同”或“一定不同”)，可以通过________________________________进行定量测定。(3)根据测定结果，①环节常选择木霉，则②中获得的酶是________酶。该酶至少包括____________________三个组分。[解析](1)从富含纤维素的环境中可以获得富含纤维素酶的微生物，这类微生物的纯化培养是以纤维素为唯一碳源，通过加入刚果红的培养基上筛选周围有透明圈的菌落而获得。(2)由于三个菌落中的细菌数目可能不同或者产酶能力不同，从三个菌落中获得三种等量酶液中酶蛋白浓度相同，其活性也不一定相同；可以通过对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定来确定三种酶液的活性。(3)木霉中产生的纤维素酶包括C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶三个组分。[答案](1)富含纤维素(其他答案合理也可，如落叶较多等)纤维素刚果红透明圈(2)不一定相同对纤维素酶催化纤维素分解后所产生的葡萄糖(3)纤维素C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶(1)生产中可以满足④环节的常见菌种是什么？为了确保获得产物乙醇，⑤环节要注意什么？(2)④过程要注意避免什么？提示：(1)酵母菌；发酵装置密闭(或保证无氧条件等)(2)杂菌污染。1．从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计正确的是()A．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→发酵培养B．土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落D．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落B[正确的实验设计一般是：土壤取样→选择培养(此步是否需要，应根据样品中的菌株数量的多少来确定)→梯度稀释→将样品涂布到有特定鉴别作用的培养基上→挑选菌落。]2．在对纤维素分解菌进行选择培养时，用液体培养基的目的是()A．可获得大量菌体B．纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长C．可以充分利用培养基中的营养物质D．可获得高纯度的纤维素分解菌A[不同物理形态的培养基其作用不一样，固体培养基用于菌种的分离、鉴定、菌落计数、菌种保藏等；液体培养基可用于获得大量菌体。][课堂小结]知识网络构建核心语句归纳1.纤维素酶是复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶等组分。2．纤维素酶的作用是：纤维素――――――→C1酶和CX酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖。3．刚果红可与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。4．分离分解纤维素的微生物的实验流程：土壤取样―→选择培养―→梯度稀释―→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上―→挑选产生透明圈的菌落5．分离后，为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。1．下列关于纤维素酶的叙述中不正确的()A．纤维素酶可将纤维素先分解为纤维二糖，再分解为葡萄糖B．纤维素酶含有C、H、O、N等元素C．用纤维素酶处理玉米根尖成熟区细胞后，将细胞放入0.3g/mL的蔗糖溶液中出现质壁分离现象D．纤维素酶是一种复合酶C[纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素酶属于蛋白质，含C、H、O、N等元素。植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素，用纤维素酶处理后。细胞壁被去除，细胞不能再发生质壁分离现象。故选C。]2．配制的某培养基的成分是纤维素粉、NaNO3、Na2HPO4·7H2O、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、酵母膏、水解酪素，该培养基能使下面哪种微生物大量繁殖()A．酵母菌B．自生固氮菌C．各种细菌D．纤维素分解菌D[该培养基的有机营养成分里面含碳的营养物质是纤维素，只有能分解利用纤维素的纤维素分解菌才能在该培养基上大量繁殖。故选D。]3．下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是()A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入B．刚果红可以在菌落形成后加入C．刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌C[刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤