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课题3酵母细胞的固定化学习目标：1.说出固定化酶的作用和原理。(重点)2.尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。(难点)1．固定化酶的应用实例——生产高果糖浆(1)反应原理：葡萄糖――――――――→葡萄糖异构酶果糖。(2)生产原理：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装入反应柱中，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液可以自由出入。(3)生产操作：①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。(4)固定化酶的优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。2．固定化酶和固定化细胞技术(1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。(2)常用方法[连线]：①－c－Ⅰ②－b－Ⅰ③－a－Ⅱ(3)载体：包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。3．固定化酵母细胞的实验操作酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合↓用固定化酵母细胞发酵←固定化酵母细胞(1)活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。(2)配制海藻酸钠溶液时，要使用小火或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。(3)溶化好的海藻酸钠溶液要先冷却至室温，再加入已活化的酵母细胞。(4)在CaCl2溶液中形成的凝胶珠需在CaCl2溶液中浸泡30min左右。1．判断对错(1)从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对酶活性影响小。()(2)作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药。()(3)尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用。()(4)将海藻酸钠凝胶珠用无菌水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌。()提示：(1)√(2)√(3)×尿糖试纸是一种酶试纸，是将葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和某种无色化合物固定在纸条上，制成测试尿糖含量的酶试纸，这种酶试纸与尿液相遇时，很快会因为尿液中葡萄糖含量的多少而呈现一定的颜色，再次使用时颜色会有掩盖作用，所以不能反复利用。(4)√2．目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列属于酶应用中面临的实际问题的是()A．酶对有机溶剂不敏感，但对高温、强酸、强碱非常敏感B．加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，比普通洗衣粉更易污染环境C．固定化酶可以反复利用，但在固定时可能会造成酶的损伤而影响活性D．酶的催化功能很强，但需给予适当的营养物质才能较长时间维持其作用C[酶对有机溶剂也非常敏感；普通洗衣粉中含有P，更容易污染环境；酶发挥催化作用时不需要提供营养物质。]固定化酶和固定化细胞技术[合作交流]1．酶能加快化学反应速率，但溶液中的酶难以回收，不能利用。要想既降低生产成本，又不影响产品质量，该如何解决这一问题？提示：将酶固定于不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与反应物分离，还可重复利用。2．从操作角度考虑，固定化酶和固定化细胞哪一种方法对酶活性的影响更小？固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？提示：固定化细胞操作更容易，对酶活性影响更小。固定化细胞可以催化一系列反应，故固定的是一系列酶。比如固定化酵母细胞将葡萄糖转化形成酒精的过程就是一系列酶催化反应的结果。3．如果反应物是大分子物质，应该采用哪种方法固定化？提示：应采用固定化酶技术。大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞不能使反应物充分反应。[归纳总结]1．固定化酶或固定化细胞的方法名称原理图示包埋法将酶或微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中，分为凝胶包埋法和微囊化法凝胶包埋法微囊化法化学结合法利用共价键、离子键将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上，分为交联法、共价结合法、离子结合法物理吸附法通过物理吸附作用，把酶或细胞固定在醋酸纤维素、琼脂糖、多孔玻璃或聚丙烯酰胺等载体上2.直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较直接使用酶固定化酶固定化细胞酶的种类一种或几种一种一系列酶常用载体无高岭土、皂土、硅胶、凝胶明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺制作方法无化学结合固定化、物理吸附固定化包埋法固定化是否需要营养物质否否是催化反应单一或多种单一一系列反应底物各种物质(大分子、小分子)各种物质(大分子、小分子)小分子物质优点催化效率高、低耗能、低污染等①既能与反应物接触，又能与产物分离，提高了产品质量②可重复使用，降低了成本成本更低、操作更容易缺点①对环境条件非常敏感，易失活②酶难回收，成本高，影响产品质量不利于催化一系列的酶促反应反应物不易与酶接触，尤其是大分子物质，可能导致反应效率下降实例果胶酶固定化葡萄糖异构酶固定化酵母细胞[典题通关]关于固定化酶技术的说法正确的是()A．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应C．固定化酶中的酶无法重复利用D．固定化酶是将酶固定在一定空间的技术D[本题主要考查对固定化酶的概念及其作用特点的理解和掌握。固定化酶是指通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与不溶性的载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应。因此，固定化酶技术固定的不是反应物而是酶。被固定的只是一种酶，不能催化一系列的酶促反应。固定化酶可以重复利用。故选D。](1)为什么固定酶不适合采用包埋法？(2)用固定的葡萄糖异构酶生产高果糖浆有何优点？提示：(1)由于酶分子较小，容易在包埋材料中遗漏，所以不适合采用包埋法固定化。(2)固定的葡萄糖异构酶能连续使用半年，大大降低了生产成本，并且提高了果糖的产量和质量。下列关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法，错误的是()A．固定化酶生物活性高，可长久使用B．一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物纯度不高C．一般酶制剂参加反应后不能重复使用D．固定化酶可以反复利用，降低生产成本A[一般酶制剂使用后，混在溶液中的酶不能回收利用，增加了生产成本；同时反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。固定化酶可重复使用，降低了生产成本，但是固定化酶使用多次后，催化效果也会下降，并不能长久使用。]固定化酵母细胞的实验操作[合作交流]1．酵母细胞固定前要活化的原因是什么？提示：在缺水状态，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的酵母细胞恢复正常的生活状态。2．在进行酵母细胞的活化操作时，为什么要选择容积很大的容器？提示：在酵母细胞活化时，体积会变大，因此要选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器。3．如何根据凝胶珠的颜色和形状确定是否制备成功？提示：可以制备不含酵母细胞的凝胶珠作对照。如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再做尝试。[归纳总结]1．实验操作流程2．制备固定化酵母细胞的注意事项(1)在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞需要的活化时间较短，一般为0.5～1h，但实验时需要提前做好准备。(2)酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出。(3)加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，关系到实验的成败，一定要按照教材的提示进行操作。加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。(4)海藻酸钠的浓度关系到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。(5)溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高而导致酵母菌死亡。(6)可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照。(7)海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右。(8)细胞的固定化要在严格无菌的条件下进行；反复使用固定化酵母细胞时，酵母菌种要纯，用具和材料要严格消毒，注意温度控制，营养全面，还需要避免其他微生物的污染。3．实验结果分析与评价(1)如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再做尝试。(2)利用固定的酵母细胞发酵产生酒精[C6H12O6――→酶2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量]，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味，而不含酵母菌的凝胶珠所做的对照实验则无此现象。[典题通关]下面是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答下列问题。酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞(1)在________状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复____________状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时__________________________。(2)固定化细胞技术一般采用包埋法，而固定化酶常用____________和____________。(3)影响实验成败的关键步骤是________________。(4)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞数目______。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明_________。[解析](1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵母细胞恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母细胞就过少；海藻酸钠浓度过高，不易与酵母细胞混合均匀。[答案](1)缺水正常的生活体积增大(2)化学结合法物理吸附法(3)配制海藻酸钠溶液(4)过少海藻酸钠浓度偏高，制作失败(1)海藻酸钠溶化过程中的注意事项是什么？(2)该实验中CaCl2溶液的作用是什么？提示：(1)要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。(2)用于海藻酸钠聚沉。下图1表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图2是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图。下列叙述不正确的是()图1图2A．刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母细胞混合制备混合液B．图1中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠C．图2发酵过程中搅拌的目的是使培养液与酵母细胞充分接触D．图1中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图2装置中A[刚溶化的海藻酸钠溶液要冷却至室温，才能与活化的酵母细胞混合制备混合液，以免高温使酵母细胞失活；混合液加入CaCl2溶液进行固定化酵母细胞，CaCl2溶液的作用是使海藻酸钠形成凝胶珠；发酵过程中搅拌的目的是使培养液与酵母细胞充分接触，以利于发酵过程的顺利进行；制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤(去除残留的CaCl2)后再转移到图2装置中进行发酵。][课堂小结]知识网络构建核心语句归纳1.酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。2．制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。3．配制海藻酸钠溶液要用小火或间断加热。4．海藻酸钠溶液浓度过高，很难形成凝胶珠；过低，凝胶珠包埋的酵母菌少。5．固定化酶固定的是一种酶，固定化细胞固定的是一系列酶。6．在制备固定化酵母细胞的过程中，溶化好的海藻酸钠溶液要冷却至室温，才能加入已活化的酵母细胞。1．有关制备固定化酵母细胞的叙述，正确的是()A．首先用蒸馏水把干酵母、CaCl2、海藻酸钠配制成溶液，但配制CaCl2溶液需要加热B．配制海藻酸钠的溶液成糊状C．海藻酸钠溶液与酵母细胞混合时，要用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀D．酵母细胞溶液首先要和CaCl2溶液混合C[配制CaCl2溶液不需要加热；配制海藻酸钠溶液需要加热，直至将海藻酸钠完全溶化；溶化好的海藻酸钠冷却至室温加入活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀。]2．下面是制备固定化酵母细胞的步骤，正确的是(