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课题3血红蛋白的提取和分离学习目标：1.了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。(重点)2.体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程与方法。(难点)1．蛋白质分离的原理和方法(1)分离蛋白质的原理蛋白质特性的差异①分子的形状和大小②所带电荷的性质和多少③溶解度④吸附性质⑤对其他分子的亲和力(2)分离蛋白质的方法①凝胶色谱法：ⅰ概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。ⅱ凝胶形态：微小的多孔球体组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道ⅲ原理：相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。②电泳：ⅰ概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。ⅱ原理：a．许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。b．在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。c．电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。ⅲ方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。(3)缓冲溶液①作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。②配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。2．蛋白质提取和分离的实验操作(1)样品处理①红细胞的洗涤：ⅰ目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。ⅱ方法：②血红蛋白的释放：ⅰ目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。ⅱ过程：③分离血红蛋白溶液：将混合液离心→将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体。(2)粗分离——透析①过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。②目的：将相对分子质量较小(填“大”或“小”)的杂质除去。③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。(3)纯化——凝胶色谱操作①凝胶色谱柱的制作：ⅰ取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。ⅱ柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。ⅲ柱顶制作：打孔→安装玻璃管。ⅳ组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。②凝胶色谱柱的装填：ⅰ色谱柱固定于支架上。ⅱ干凝胶的计算和称量。ⅲ溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。ⅳ装填：打开下端出口，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。ⅴ洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20mmol/L的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12h。③样品的加入和洗脱：调整缓冲液面：与凝胶面平齐↓滴加透析样品：用量为1mL↓样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层↓洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱↓收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集(4)纯度鉴定在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。1．判断对错(1)可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质。()(2)用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质。()(3)透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜。()(4)凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法。()提示：(1)×猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，不能从其红细胞中提取出DNA。(2)√(3)√(4)√2．下列各项中，不是电泳使样品中各种分子分离的原因的是()A．带电性质差异B．分子的大小C．分子的形状D．分子的变性温度D[电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，而迁移速度与分子的变性温度无关。]3．蛋白质提取和分离的一般步骤是()①样品处理②凝胶色谱操作③粗分离④SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳⑤纯化⑥纯度鉴定A．①②③④⑤⑥B．①③⑤⑥C．③④⑤⑥D．①③④⑤B[蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。]蛋白质提取与分离的原理和方法[合作交流]1．凝胶色谱法分离过程是怎样的？提示：蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。2．凝胶的成分是什么？凝胶有何特点？提示：成分：大多数是多糖类化合物构成的一些微小的多孔球体，如葡聚糖或琼脂糖。特点：小球体内部有许多贯穿的通道，可以分离不同相对分子质量的蛋白质。[归纳总结]1．蛋白质分离的依据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。2．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析相对分子质量大相对分子质量小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径小于凝胶颗粒空隙直径运动方式垂直向下运动无规则的扩散运动运动速度较快较慢运动路程较短较长洗脱顺序先从凝胶柱中洗脱出来后从凝胶柱中洗脱出来3.电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁的大小、形状的不同移速率完全取决于分子的大小[典题通关]如图表示对某蛋白质溶液进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是()A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动B．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少C．蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度取决于其相对分子质量的大小D．电泳结果表明溶液中的蛋白质可能有两种，也可能只有一种B[蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带的电荷，故其移动速度与本身所带电荷多少无关，而由其分子大小决定。SDS可使蛋白质变性形成肽链，故结果所示可能是一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。](1)图中的两个分子所带的电荷是正电荷还是负电荷？为什么？(2)除了本题中的聚丙烯酰胺凝胶电泳外，常用的电泳方法还有哪种？提示：(1)负电荷，因为它们移向了阳极一端。(2)琼脂糖凝胶电泳法。1．利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是()A．相对分子质量大的B．溶解度高的C．相对分子质量小的D．所带电荷多的A[相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。]2．下列有关缓冲溶液的说法，不正确的是()A．缓冲溶液能够抵制外界任何酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液D．生物体内的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的A[缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液。在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，超过一定范围，缓冲溶液就起不到这样的作用了。]血红蛋白的提取和分离实验操作[合作交流]1．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？提示：(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。[归纳总结]1．样品处理、分离与纯化的目的不同目的红细胞洗涤去除杂质，如血浆蛋白血红蛋白释放使红细胞破裂，释放血红蛋白分离血红蛋白溶液经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开透析除去样品中相对分子质量较小的杂质纯化除去相对分子质量较大的蛋白质2.结果分析与评价项目分析血液样品的处理①分层明显―→样品处理完成；②分层不明显的原因：a.洗涤次数少，未能除去血浆蛋白；b.离心速度过高或时间过长凝胶色谱柱的装凝胶颗粒填充紧密、均匀，无气泡―→装填成功填血红蛋白的分离①血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出―→分离成功；②血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽―→分离效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关[典题通关]如图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是()A．首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质B．图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5mL，连续收集D．图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动B[用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。](1)在凝胶色谱操作前，获得的血红蛋白溶液中的杂质应尽量除去，哪些操作是为了达到这一目的？(2)丙图中决定蛋白质运动方向和速度的因素有哪些？提示：(1)①用生理盐水对红细胞进行洗涤，目的是洗去红细胞表面上的杂蛋白；②离心分层，目的是除去一些脂溶性物质；③透析，目的是除去一些小分子的杂质。(2)蛋白质所带电荷的性质、分子的大小和形态等。在蛋白质的提取和分离中，关于对样品的处理，分析正确的是()A．洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐B．洗涤时离心速度过慢，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果C．洗涤过程选用质量分数为0.1%的NaCl溶液D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质D[本题主要考查了血红蛋白提取和分离中的样品处理。洗涤红细胞的目的主要是除去血浆中的蛋白质；洗涤时离心速度过快，时间过长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程用到的是质量分数为0.9%的NaCl溶液。故正确答案为D。][课堂小结]知识网络构建核心语句归纳1.凝胶色谱法分离蛋白质取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的路程较短，移动速度快；相对分子质量较小的，路程较长，移动速度慢。2.缓冲液能在一定范围内抵制外界酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。3.电泳时，带电分子会向其所带电荷相反的电极移动。4.蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。5.在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状都会影响分子的迁移速度。6.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。1．下列关于样品的加入和洗脱的操作不正确的是()A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D．用吸管小心地将1mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A[加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐。]2．相对分子质量