PCR数据分析处理

PCR数据分析处理PCR•定义•FQ-PCR与RT-PCR的关系及区别操作•反应体系配制•热循环参数结果•扩增曲线与Ct值•相对表达量计算•统计分析2008-11-271PCR定义PCR（PolymeraseChainReaction，聚合酶链反应）是一种选择性体外扩增DNA或cDNA的技术。特点：它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。分类：最常用的FQ-PCR与RT-PCR。返回2008-11-272FQ-PCR与RT-PCR的关系及区别RT-PCR：逆转录PCR，将mRNA逆转录后再进行PCR扩增，产物通过电泳检测基因的表达情况，又称半定量PCR。FQ-PCR：实时荧光定量PCR，在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板定量的方法。联系及区别：RT-PCR只能进行定性；FQ-PCR才能做到定量。返回2008-11-273反应体系配制以FQ-PCR为例，体系中的组分如下10×buffer(Mg2+free)MgCl2（25mM）dNTP（25mM）上游引物（10µM）下游引物（10µM）探针或染料（10µM）Taq酶（5u/µl）ddH2OcDNA模板返回2008-11-274热循环参数stage194℃2minStage2探针：94℃20sec，55℃（基因的复性温度）20sec，60℃30sec，45cycles染料：94℃20sec，55℃（基因的复性温度）20sec，72℃30sec，80℃20sec，45cycles返回2008-11-275扩增曲线与CT值go2008-11-276相对表达量计算返回2008-11-277相对表达量计算用样本的基因的Ct值减去对应的内参的Ct值，得到△Ct值例子：假设1号样本的基因的Ct值为23，1号样本的内参的Ct值为19，则1号样本的△Ct值=23-19=4。根据△Ct值就可以分析我们的基因的表达情况了，△Ct值越大，则样本的基因的表达越低。取一个参照组的△Ct值的平均值作为对照基准，用每个标本的△Ct值减去参照组的△Ct值，得到△△Ct值。参照组是指你所要比较的对象，比如空白对照组等。计算出2-△△Ct值，就可以进行统计分析了。2-△△Ct值的意义：每个样本的基因的表达是参照组的基因表达平均值的多少倍？也就是我们说的相对定量。返回2008-11-278统计分析Rest软件分析后处理分析完结果后，请根据需要给出拷图要求通过书面或者邮件的形式给出下列要求拷图主要是为了说明各组的表达的差异，也就是选取每个组选出有代表性的标本组成一张图。返回2008-11-279问题讨论标准曲线有什么用？解答：标准曲线可以指示基因的扩增效率，并且在有已知拷贝数的标准品的情况下可以算出标本的起始拷贝数。但是我们做的大部分都是相对定量，就是看标本间的表达的关系，并没有用已知拷贝数的标准品做绝对定量的标准曲线，并且也没有必要做出他们的起始拷贝数。我们只需要做出他们之间关系就可以了。因此我们做的标准曲线就是指示基因的扩增效率，而没有做出样本的起始表达量，我们也可以在图上看出他们的关系，就是相对的倍数关系。扩增效率就是10-1/k，其中k就是标准曲线的斜率。我们算出的效率基本一致就可以了，那样我们的相对定量才成立，并且在统计时，不一定要用算出的扩增效率，用2也是可以的。返回2008-11-2710问题讨论Ct值为什么不能机读？解答：如下图：机器读数是根据曲线与阈值线的交点对应的循环数，但是如E4，因为曲线不规则，所以机器读数就不正确，这种情况下只能采取人工读数的方法，而人工读数在肉眼可见的情况下只能精确到0.1，这就是为什么大家拿到的数据精确度只有0.1的原因。go2008-11-2711