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专题3植物组织培养技术一、基础知识课题1：菊花的组织培养（1）细胞的分化①概念：在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程②过程：1、植物的组织培养的基本过程③特点：（2）稳定性：（1）持久性：一般来说，分化了的细胞将一直保持分化后的状态，直到死亡（3）普遍性：⑤原因：基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果④结果：形成不同的细胞和组织（2）细胞的全能性①定义：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质已分化的植物细胞，仍具有全能性③实例受精卵生殖细胞体细胞④全能性的比较:（3）植物组织培养细胞离体①必要条件：一定的营养物质、激素和其他外界条件②原理:细胞的全能性外植体：离体的器官、组织、细胞③相关概念:脱分化：再分化：细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。也叫去分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程愈伤组织:人参的愈伤组织菠萝的愈伤组织2、影响植物组织培养的因素（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难B、同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝A、植物材料的选择直接关系到实验的成败（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置适宜的培养基MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有机物、植物激素①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素类：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影响②生长素和细胞分裂素作用植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率高生长素细胞分裂素：有利于根的分化生长素细胞分裂素：有利于芽的分化，抑制根的分化生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织生长③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h3、植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化植物细胞培养不需要光需要光1、培育无病毒植株2、培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法4、植物组织培养的应用：3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题二、实验操作（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备1、配置各种母液①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量2、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml①配制培养液②调PH③培养基的分装由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为70％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒。培养温度18~22℃，每日用日光灯光照12h（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间（六）栽培3、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花植物的花药培养在育种上有什么意义？花粉粒（1N）单倍体植株（1N）二倍体纯合子植株（2N）缩短了育种周期，为新品种的培育开辟了新途径。花的结构花丝花药：囊状结构，内有很多花粉花粉是由花粉母细胞（即小孢子母细胞）经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期等阶段。（一）被子植物的花粉发育雄蕊（一）被子植物的花粉发育1花粉母细胞（2n）4个小孢子(小孢子四分体)（n）减分有分1个花粉管细胞核（n）1个生殖细胞核（n）有分2个精子单核居中期（n）单核靠边期（n）注意：•①二核花粉粒：成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。（精子在花粉管中形成）•②三核花粉粒：有些植物的花粉，在成熟前，生殖细胞进行一次有丝分裂，形成两个精子，这样的花粉在成熟时，含有一个营养核和两个精子。•③两个精子和一个营养核的基因型相同。（二）产生花粉植株的两种途径形成原因：主要取决于培养基中的激素的种类及其浓度的配比体细胞胚（胚状体）：在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为体细胞胚（胚状体）。（三）影响花药培养的因素1、材料的选择不同植物同一植物的不同生理状况（花期早期－初花期）合适的花粉发育期（单核居中期与靠边期之间）此外，植株生长条件、材料低温预处理、接种密度等2、培养基的组成实验操作材料选取材料和消毒接种和培养（一）材料选取通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。最常用的方法：醋酸洋红法。某些植物的花粉细胞核不易着色，采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。月季的初花期。选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。二、材料的消毒：花蕾（70％酒精）大约30s（无菌水）清洗（无菌吸水纸）吸干水分（1％氯化汞溶液）2～4min（无菌水）冲洗月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗三、接种和培养剥取花药接种花药培养分化培养基培养鉴定和筛选不要损伤花药？要彻底除去花丝？常常会出现染色体倍性的变化？每个培养瓶接种（7～10）个花药？花药长出愈伤组织还要转移到哪？主要原因是营养核和生殖核融合造成的植物组织培养技术与花药培养技术的异同点项目相同点不同点植物组织培养技术离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。外植体为体细胞，染色体数无需加倍。花药培养技术取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。