第八章酶法分析ppt课件

生化分析（BiochemicalAnalysis）生命科学与生物工程罗云敬生化分析酶分析法蛋白质分析免疫分析核酸分析氨基酸分析糖的分析生物大分子分离纯化技术课程主要内容：第一章酶催化反应，酶法分析的检测技术。第二章蛋白质的分类及结构，蛋白质分析方法。第三章免疫分析方法的建立、优化及其应用。第四章核酸的定量及结构分析,DNA序列测定,核酸分子杂交分析。第五章氨基酸的定量和选择性分析。第六章糖的化学和酶法分析,糖混合物的分离鉴定。第七章分光光度和荧光光谱的原理，谱图分析，实验设计技巧。第八章液相色谱原理及色谱仪的基本装置，关键技术。第九章主要电泳与离心方法,操作要领。第八章酶法分析酶及酶催化反应酶法分析的检测技术酶固定化技术与酶传感器酶活性测定的应用什么是酶？酶是生活细胞产生的，具有催化作用的蛋白质。酶是生物体内具有催化活性的，有特殊空间构像的生物大分子，包括蛋白质和核酸。酶是生活细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂。酶的特性来源于生物体催化效率高（是化学催化剂的107_1013倍）高度的特异性（底物专一性）易失活（高温、强酸、强碱、重金属盐及紫外线）3、反应条件温和酶促反应一般在pH5-8水溶液中进行，反应温度范围为20-40C。高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。4、酶易失活凡能使蛋白质变性的因素如强酸、强碱高温等条件都能使酶破坏而完全失去活性。所以酶作用一般都要求比较温和的条件如常温、常压和接近中性的酸碱度。5、酶活力可调节控制如抑制剂调节、共价修饰调节、反馈调节、酶原激活及激素控制等。６、某些酶催化活力与辅酶、辅基及金属离子有关。1.1酶及酶催化反应1.1.1酶的单位酶活力（EnzymeActivity）：在一定条件下，单位时间内底物的减少量或产物的增加量。酶的国际单位（InternationalUnit，IU）：在特定条件下1min将1umol的底物转化为产物所需酶的量。卡特尔（Katal）：1Katal为1s内将1mol底物转化为产物所需酶的量。（1katal=6×107UI）酶的比活力（SpecificActivity）：每毫克每蛋白所具有的催化活性，即IU/mg1.1.2酶催化反应的类型及酶的编号1.氧化还原酶类Oxidoreductases2.转移酶类Transgerases3.水解酶类Hydrolases4.裂合酶类Lyases5.异构酶类Isomerases6.连接酶类Ligases酶的编号ECW.X.Y.Z酶学委员会催化反应的类型亚类亚亚类系统编号例：醇脱氢酶（EC1.1.1.1)EC：EnzymeCommission（酶学委员会）1：氧化还原酶类1：以CH—OH基为供体的酶类1：代表NAD或NADP为受体1：同一类酶的顺序编号，与发现的先后一致1.1.3酶催化反应的特性酶反应与非酶反应活化能的比较：酶对反应的加速是通过形成酶与底物的复合物以降低反应的活化能△G而实现的1.1.3酶催化反应的特性酶活性中心的化学结构，诱导使底物的化学键变形或极化——提高底物基态的能量。底物与酶的结合部位对底物的固定化作用，使底物分子进入酶的活性中心，使得很多反应类似于分子内反应（接近效应）——提高了活性中心的底物有效浓度。1.1.3酶催化反应的特性底物正确而有利的定向，底物反应时键只最小程度的移动或旋转，电荷分布和有利的几何形状——降低反应所需活化能。多功能基团间的协同催化作用酶活性中心的特点概念：酶结合底物（辅基）以及提供直接参与键形成和断裂的残基的区域。特点：（1）活性部位只占酶整体的一小部分，即每分子中大多数残基并不与底物接触。（2）酶的活性部位是一个三维实体，由来自氨基酸序列上的不同部位的残基所组成酶活性中心的特点（3）酶的三维活性中心是裂缝或裂隙，常是一个疏水的环境，底物就存在于这样的环境中。（4）底物与酶之间是以一种弱的力结合在一起。（5）结合的专一性取决于活性中心部位中原子的确定排布方式——诱导契合学说1.1.4酶催化反应的动力学一级反应：在低底物浓度时,反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。速度∝k[试剂]二级反应：速度∝k[试剂1][试剂2]零级反应：当底物浓度达到一定值，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应.k：反应速率常数酶反应速度与底物浓度的关系米氏方程E＋SESP＋Ek1k2k3k44321mkkkkk132kkkkm反应初始阶段产物浓度比较小，假设不发生逆反应酶底物中间产物产物酶][][maxSkSvvm当底物浓度较低时，[S]km,v=[S]vmax/kmax,反应速度与底物的浓度成正比。当底物浓度很高时，[S]km,,v=vmax,，反应速度达到最大值，不再随底物浓度改变方程假设条件：1.稳态；2.测反应的初速度；3.[S][E]米氏常数km的意义不同的酶具有不同km值，它是酶的一个重要的特征物理常数。km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的km值。当[S]=km时，v=vmax/2，因此km在数值上等于当反应速度为最大反应速度值一半时底物的浓度。km值表示酶与底物之间的亲和程度：km值大表示亲和程度小，酶的催化活性低;km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高mESkkkkkkESSEk13212][]][[k2k3时kES为ES复合物的解离常数米氏常数的测定改变底物浓度，便可以得到如前图所示曲线，找出vmax。但是在实验上一般误差较大：双曲线图型，不易确定。若找不到真正的vmax，任何对vmax的推测，都会反映在由此确定的km上][][maxSkSvvmLineweave-Burk方程（双倒数方程）maxmax1][11vSvkvm-4-202468100.00.20.40.60.81.01/[S](1/mmol.L-1)1/v斜率=Km/Vmax-1/Km1/Vmax其他方程两边求对数：以v对p[S]作图，v=vmax/2时，p[S]=pkm。还可变换为：以[S]/v对[S]作图，得一直线，横轴截距为-km，vvvmpkSpmaxlg][maxmax][][vSvkvSm酶催化反应机理锁匙学说可以很好的解释酶的特异性，但是将酶看成了刚性分子诱导契合模型诱导楔合学说的四个要点A.酶有其原来的形状，不一定一开始就是底物的模板B.底物能诱导酶蛋白的形状发生一定变化（专一性结合）C.当酶的形状发生变化后，就使得其中的催化基团形成正确的排列。D.在酶反应过程中，酶活性中心构象的变化是可逆的。即酶与底物结合时，产生一种诱导构象，反应结束时，产物从酶表面脱落，酶又恢复其原来的构象。酸碱催化在酶促反应中，酶分子的某些功能基团可作为酸或碱通过瞬间向底物提供质子或从底物分子抽取质子，相互作用而形成过渡复合物，使活化能降低，加速反应进行，称作酸碱催化（acid-baseratalysis）酸碱催化酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和广义的酸-碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。广义酸－碱催化是指通过质子酸提供部分质子,或是通过质子碱接受部分质子的作用，达到降低反应活化能的过程。共价催化催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。酶中参与共价催化的基团主要包括以下亲核基团：His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羟基等；亲电子基团：H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。1.1.5影响酶催化反应的因素温度pH值底物及酶的浓度酶的活化酶活性的抑制温度一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大102030405060708090020406080100TemperatureOCRelativeActivity(%)注意：A人体温度（37℃）不等于最适温度B国际生物化学联合会最初推荐25℃为酶反应的标准温度，后来由于在热的气候环境下很难控制这一温度，所以将标准温度提高到30℃酸度（pH值）在一定的pH下,酶具有最大的催化活性,通常称此pH为最适pH主要影响氨基酸的侧链解离状态和底物分子解离状态底物及酶的浓度Vmax=K3[E][E]V=Vmax[S]Km+[S]酶的活化酶按其组成分为两类：简单蛋白酶：指酶的活性仅仅决定于它的蛋白质结构。如脲酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。结合蛋白酶：这些酶只有在结合了非蛋白组分（辅助因子）后，才表现出酶的活性。主要为一些金属离子和有机化合物，如生物素、铁卟啉、ATP等酶活性的抑制降低酶催化反应速度的物质称为酶反应的抑制剂（Inhibitor）竞争性抑制可逆抑制非竞争性抑制反竞争性抑制不可逆抑制不可逆抑制作用（irreversibleinhibition)许多毒物和药物就是通过抑制酶的活性来作用的：神经毒剂对于乙酰胆碱酯酶的抑制抑制剂与酶蛋白中的必需基团以共价形式结合，引起酶的永久性失活,不能用透析或超滤等物理方法除去抑制剂而恢复酶活性。专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂只作用于与酶活性部位有关的氨基酸残基或一类酶。非专一性不可逆抑制作用：这类抑制剂作用于酶分子上不同的基团或作用于几类不同的酶。如：酰化剂酸酐和磺酰氯等可使酶蛋白的-OH、-SH、-NH2等发生酰化。可逆抑制作用(reversibleinhibition)抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引起酶活性暂时性丧失。抑制剂可以通过透析等方法被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：a.竞争性抑制作用b.非竞争性抑制作用C.反竞争性抑制作用竞争性抑制作用某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。竟争性抑制非竞争性抑制作用抑制剂与酶活性中心以外的部位结合，因此既可同游离酶结合，又可同酶－底物复合物结合，这种作用称非竞争性抑制作用。非竞争性抑制剂与酶活性中心以外的基团结合。这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱非竟争性抑制反竞争性抑制作用酶只有与底物结合后才与抑制剂结合，从而导致酶活性下降。这类抑制作用最不重要。1.2酶法分析的检测技术在酶法分析中，被分析的对象可以是酶、底物、底物类似物、酶的活化剂或抑制剂等凡是可以影响酶催化反应的各种物质都有可能被分析酶活性检测只能用动力学相关的方法；而对于底物可以用动力学方法也可以用平衡法常用的方法有：初速度法、固定时间分析法、固定变化分析法、平衡法以及酶偶联分析法等。1.2.1酶活性的检测可以测定酶作用底物浓度的减少或产物的积累。（应该选用哪一个比较方便？）通常选用测定产物的增加量，因为产物浓度有无到有，由低变高比较容易观察和测定；而底物浓度通常大大过量，反应过程中浓度变化较小，不易测准。常用分析方法：•分光光度法•滴定法•电化学分析法•荧光光度法•比旋光度法等后面详细说明初速度法酶促反应的初速度最大，且能保持恒定。但是恒定的时间一般很有限，初速度的测定必须在此范围能进行。并不是所有的酶反应的初速度都与酶的活性成正比。为了确定这一点，一般可以取三个酶浓度测定反应的初速度。若测定的初速度与酶浓度之间呈线性关系，则说明所选择的条件是合适的。为了真实地反映酶的活性，一般要采用过量的底物（浓度为km的10倍以上），使所有酶的活性位点都被饱和。此时，对于底物来说是零级反应，对于酶来说为一级反应。固定时间分析法间隔一定的时间，分几次取出一定体积的反应