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Ⅰ中华人民共和国农业行业标准NY/T1756—2009饲料中孔雀石绿的测定Determinationofmalachitegreeninfeeds2009-04-23发布2009-05-20实施ICS65．120B46华国国国中人民共和部发布NY/T1756—2009Ⅰ前言本标准附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国国国部畜牧国司提f“。本标准由全国饲料工国标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国国国科学院国国质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)]、浙江省饲料监察所。本标准主要起草人：李兰、索德成、应永飞、闫惠文、杨曙明、朱聪英、杜洪鸽、谭旭信。NY/T1756—20091饲料中孔雀石绿的测定1范围本标准规定了用液相色谱仪和液相色谱-串联质谱仪测定饲料中的孔雀石绿及其同系物无色孔雀石绿含量的方法。本标准分为高效液相色谱法和高效液相色谱串联质谱法，高效液相色谱-串联质谱法为确证法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、鱼粉中孔雀石绿和无色孔雀石绿含量的测定。液相色谱法孔雀石绿和无色孔雀石绿的定量限均为10µg／kg；液相色谱-串联质谱法的定量限均为1.0µg／kg。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法GB／T14699．1饲料采样GB／T20195动物饲料试样的制备3采样按GB／T14699．1执行。4试样的制备选取有代表性饲料样品，按GB／T20195制备样品，过0.28mm孔筛。5液相色谱法5．1原理以乙腈-乙酸钠缓冲溶液提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过二氯甲烷液液萃取，再经固相萃取柱净化，用接有二氧化铅柱的氰基柱进行高效液相色谱分离，紫外可见光检测器检测，外标法定量。5．2试剂除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB／T6682规定的一级用水。5．2．1孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95％。5．2．2无色孔雀石绿标准品：纯度≥95％。5．2．3乙腈：色谱纯。5．2．4二氯甲烷。5．2．5盐酸羟胺溶液：称取12.5g盐酸羟胺溶于50mL水中。5．2．6乙酸钠缓冲溶液：称取4.95g无水乙酸钠和0.95g对甲苯磺酸于900mL水中，用冰乙酸调节pH4.5，用水定容至1000mL。NY/T1756—200925．2．71.0mol／L对甲苯磺酸溶液：称取17.2g对甲苯磺酸，加水溶解并定容至100mL。5．2．8酸性氧化铝，粒度为0.071nm～0.1501nm，层析用。5．2．9乙腈-乙酸钠缓冲溶液：乙腈＋乙酸钠＝60＋40(v＋v)。5．2．10氯化钠溶液：称取25g氯化钠，加水溶解并定容至500mL。5．2．11孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取孔雀石绿草酸盐(5．2．1)0.1000g，用乙腈溶解，定容至100mI。该溶液中孔雀石绿的浓度为1mg／mL，于－18℃保存可使用3个月。5．2．12无色孔雀石绿标准贮备溶液：精确称取无色孔雀石绿(5．2．2)0.1000g，用乙腈溶解，定容至100mL，该溶液中无色孔雀石绿浓度为lmg／mL，于－18℃保存可使用3个月。5．2．13孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液：精确移取孔雀石绿标准贮备溶液(5．2．11)和无色孔雀石绿标准贮备溶液(5．2．12)各0.5mL，置于50mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为10µg／mL，于2℃～8℃保存可使用1个月。5．2．14孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液：精确移取孔雀石绿和无色孔雀石绿混合中间液(5．2．13)1mL，置于100mL棕色容量瓶中,用乙腈乙酸钠缓冲溶液(5．2．9)定容至刻度。该溶液中孔雀石绿和无色孔雀石绿均为100ng／mL，于分析前配制使用。5．2．15盐酸羟胺甲醇溶液：取1mL盐酸羟胺溶液(5．2．4)，加甲醇定容至100mL。5．3仪器5．3．1高效液相色谱仪：配紫外可见光检测器。5．3．2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。5．3．3离心机，转速4000r／min。5．3．4振荡器。5．3．5旋转蒸发器，可控温25℃～40℃。5．3．6固相萃取柱：丙基磺酸阳离子树脂PRS(propylsulfonicacid)柱：200mg／5mL～500mg／5mL中性氧化铝柱：500mg／6mL～l000mg／6mL。5．3．7色谱柱：氰基柱(粒度为5µm)，柱长250mm、内径4.6mm。5．3．8二氧化铅柱：柱长35mm、内径4.6mm。5．4分析步骤5．4．1提取称取饲料样品约5g(精确到0.001g)，置于100mL离心管中，依次加入1.5mL盐酸羟胺溶液(5．2．5)、2mL对甲苯磺酸溶液(5．2．7)、5mL乙酸钠缓冲溶液(5．2．6)和20mL乙腈，加入约2g酸性氧化铝(5．2．8)，振荡2min，超声30min,4000r／min离心5min。将上清液转移至250mL分液漏斗中，向离心管中再次加入20mL乙腈，振摇2min，4000r／min离心5min，合并上清液至分液漏斗中。5．4．2液液萃取加入50mL氯化钠溶液(5．2．10)、50mL二氯甲烷(5．2．4),旋摇,静置分层。用蒸发瓶收集下层液体后，在分液漏斗再次加入20mL二氯甲烷,旋摇,静置分层，收集下层液体于同一蒸发瓶。将收集液在35℃下减压旋转蒸发(注意：开始时温度不要直接升到35℃，以免爆沸)至近干，加入5mL乙腈溶解残渣，备用。5．4．3净化5．4．3．1固相萃取柱的活化按中性氧化铝柱在上、PRS柱在下的顺序将两柱串联，使用前用5mL乙腈预洗两柱。5．4．3．2上样将5．4．2的样液缓慢转移到中性氧化铝柱内,在抽真空情况下过柱(保持流速1mL／min)。再用5NY/T1756—20093mL乙腈洗涤蒸发瓶2次，洗涤液均转移至柱内，最后用5mL乙腈洗涤小柱。5．4．3．3洗脱收集弃去中性氧化铝柱,用乙腈-乙酸钠缓冲溶液(5．2．9)2mL、盐酸羟胺甲醇溶液(5．2．15)lmL洗脱，收集洗脱液，过膜(孔径0.45µm)，上机测定。5．4．4样品测定5．4．4．1色谱条件色谱柱：氰基柱，250mm×4.6mm，柱后氧化铅柱：35mm×4.6mm。流动相：乙腈＋乙酸钠缓冲溶液＝60＋40(v＋v)；流速：1.0mL／min。柱温：室温。进样量：50µL。检测波长：600nm。5．4．4．2定量测定按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数。向液相色谱仪中注入孔雀石绿和无色孔雀石绿标准工作液(5．2．13)及试样溶液(5．4．3．3)，得到色谱峰面积响应值，用外标法定量。5．4．4．3结果计算试样中孔雀石绿和无色孔雀石绿的含量Wi，以质量分数表示，单位为微克每千克(µg／kg)，按式(1)分别计算：iististiPVCVWPmV×××××＝…………………………………………(1)式中：Pi——试样溶液峰面积值，V——样品的总稀释体积，单位为毫升(mL)；Ci——标准溶液浓度，单位为纳克每毫升(ng／mL)；Pst——标准溶液峰面积平均值；m——试样质量，单位为克(g)。平行测定结果用算术平均值表示，保留3位有效数字。5．5重复性同一分析者对同一试样同时2次平行测定结果的相对偏差不大于15％。6液相色谱-串联质谱法6．1原理以乙腈提取样品中的孔雀石绿和无色孔雀石绿，提取液经过固相萃取柱净化后，进行液相色谱-串联质谱仪测定，以内标法定量。6．2试剂除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB／T6682规定的一级用水。6．2．1乙腈：色谱纯。6．2．2甲醇：色谱纯。6．2．3氨水。6．2．4冰乙酸。6．2．5酸性氧化铝：粒度为：0.071nm～0.150lnm，层析用。6．2．6甲酸：优级纯。6．2．7孔雀石绿草酸盐标准品：纯度≥95％。NY/T1756—200946．2．8无色孔雀石绿标准品：纯度≥95％。6．2．9氘代孔雀石绿标准品：纯度≥95％。6．2．10氘代无色孔雀石绿标准品：纯度≥95％。6．2．11甲酸溶液：1.0％，取甲酸1.0mL加水定容至100mL。6．2．12中性氧化铝柱：1g／6mL。6．2．13PRS阳离子交换柱：500mg／5mL。6．2．14流动相：取0.1％甲酸溶液220mL，加入乙腈780mL，摇匀。6．2．15淋洗液：取甲酸溶液20mL，加乙腈定容至100mL。6．2．16洗脱液：取氨水5mL加甲醇至100mL，摇匀。6．2．17标准储备溶液：准确称取孔雀石绿革酸盐、无色孔雀石绿、氘代孔雀石绿、氘代无色孔雀石绿标准品，用乙腈分别配制成100µg／mL的标准贮备液，－18℃避光保存备用，有效期为3个月。6．2．18混合标准储备溶液：分别吸取孔雀石绿和无色孔雀石绿的标准储备溶液(6．2．17)，用乙腈稀释成1µg／mL，－18℃避光保存，有效期为1个月。6．2．19混合内标储备溶液：分别吸取氘代孔雀石绿和氘代无公孔雀石绿标准储备溶液(6．2．17)，用乙腈稀释成1µg／mL，－18℃避光保存，有效期为1个月。6．2．20混合内标工作溶液：用乙腈稀释内标储备溶液(6．2．19)，配制成每毫升含氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿各100ng的混合内标工作溶液，－18℃避光保存，有效期为1个月。6．2．21混合标准工作溶液：根据需要，临用时用流动相稀释混合标准储备溶液(6．2．18)和混合内标储备溶液(6．2．19),配制成适当浓度的混合标准工作溶液，每毫升混合标准工作溶液含有氘代孔雀石绿和氘代无色孔雀石绿各100ng。6．3仪器6．3．1高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾(ESI)离子源。6．3．2电子天平：感量0.0001g、感量0.001g。6．3．3离心机，转速8000r／min。6．3．4振荡器。6．3．5旋转蒸发器，可控温35℃～60℃。6．3．6固相萃取装置。6．4分析步骤6．4．1试样提取称取饲料样品约5g(精确到0.001g)，置于50mL离心管中，依次加入200µL混合内标工作液(6．2．17)、约5g中性氧化铝(6．2．5)、20mL乙腈，涡旋混匀，超声30min；于8000r／min离心10min，倾出上清液至旋转蒸发瓶中,另取20mL乙腈重复提取一次，合并上清液；在35℃下减压蒸至近干，用5mL乙腈溶解残渣，备用。6．4．2试样净化将中性氧化铝柱(6．2．12)串接在阳离子交换柱(6．2．13)上方，用5mL乙腈活化。取溶液(6．4．1)过柱，另取5mL乙腈清洗旋转蒸发瓶，溶液过柱，重复以上操作一次，取5mL乙腈淋洗柱子。移去中性氧化铝柱，用5mL淋洗液(6．2．15)淋洗阳离子交换柱，弃去流出液，抽干；用5mL洗脱液(6．2．16)洗脱。收集洗脱液，用氮气在50℃吹至近干，用流动相(6．2．14)溶解残渣，并定容到适当的体积，经0.22µm滤膜过滤后上机测定。6．4．3色谱条件NY/T1756—20095色谱柱：C18柱(150mm×2.1mm，3.5µm)；流动相：0.1％甲酸溶液＋乙腈＝22＋78(v＋v)；流速：0.25mL／min；柱温：50℃；进样量：20µL。6．4．4质谱条件离子源：电喷雾ESI离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；雾化气、锥孔气均为高纯氮气；碰撞气为高纯氦气；使用前,应调节各气体流量,以使质谱灵敏度达到检测要求；喷雾电压、碰撞能等电压值应优化至最优灵敏度；监测离子对情况见表1。表1孔雀石绿和无色孔雀石绿的离子对名称定量离子对，m／z定性离子对，m／z孔雀石绿329／313329／208无色孔雀石绿331／239331／316氘代孔雀石绿334／318氘代无色孔雀石绿337／2406．4．5定性测定每种被测组分选择1个母离子、2个以上子离子。在相同试验条件