NYT 1103.2-2006 仅供参考

NY中华人民共和国农业行业标准NY/T1103.2－2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定SafetyassessmentofgeneticallymodifiedplantandderivedproductsPart2:assayofanti-nutrientspancreatictypsininhibiter2006-07-10发布2006-10-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T1103.2－2006前言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、农业部科技发展中心、中国农业大学、天津市卫生防病中心。本标准主要起草人：杨月欣、王竹、韩军花、李宁、汪其怀、黄昆仑、刘克明、刘培磊、连庆。本标准首次发布。NY/T1103.2－2006转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分：胰蛋白酶抑制剂的测定1范围本标准规定了转基因植物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定方法。本标准适用于转基因大豆及其产品、转基因谷物及其产品中胰蛋白酶抑制剂的测定。其他的转基因植物，如花生、马铃薯等也可用该方法进行测定。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1转基因植物geneticallymodifiedplant指利用基因工程技术改变基因组构成，用于农业生产或者农产品加工的植物。2.2转基因植物产品productsderivedfromgeneticallymodifiedplant指转基因植物的直接加工产品和含有转基因植物的产品。3原理胰蛋白酶可作用于苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPA），释放出黄色的对硝基苯胺，该物质在410nm下有最大吸收值。转基因植物及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应，使吸光度值下降，其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度计在410nm处测定吸光度值的变化，可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。4试验材料转基因植物及其产品、受体植物及其产品。如果对转基因植物产品中的胰蛋白酶抑制剂进行测定，转基因植物产品和受体植物产品的处理条件应相同。上述材料的水分含量和种植环境应基本一致。5试剂除非另有说明，仅使用分析纯试剂；水为蒸馏水。5.1三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]。5.20.05mol/LTris缓冲液：称取6.05gTris和2.94g氯化钙（CaCl2·2H2O）溶于800mL水中，用浓盐酸调节溶液的pH值至8.2，加水定容至1L。5.30.01mol/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠，加入800mL水溶解后，再加水定容至1L。5.4戍烷：已烷（1：1，V：V）。5.51mmol/L盐酸。5.6胰蛋白酶：大于10,000BAEEu/mg。BAEE为N－苯甲酰-L-精氨酸乙烷酯（N-benzoyl-L-arginineethylester）。BAEEu（BAEE单位）表示胰蛋白酶与BAEE在25C、pH7.6、体积3.2mL条件下反应，在253nm波长下每分钟引起吸光度值升高0.001，即为1个BAEEu。5.7胰蛋白酶溶液：称取10mg胰蛋白酶，溶于200mL1mmol/L盐酸中。5.8苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺（benzoyl-DL-argininep-nitroanilide,BAPA）。5.9BAPA底物溶液：称取40mgBAPA，溶于1mL二甲基亚砜中，用预热至37℃的Tris缓冲液稀释至100mL。BAPA底物溶液应于实验当日配制。5.10反应终止液：取30mL冰乙酸，加水定容至100mL。6仪器和设备6.1通常实验室仪器设备。6.2恒温水浴箱。6.3分光光度计。6.4旋涡搅拌器。6.5电磁搅拌器。7操作步骤7.1试样的制备将试验材料磨碎，过筛（筛盘为100－200目）。称取0.2－1g试样，加入50mL0.01mol/L氢氧化钠溶液，pH值应控制在8.4－10.0之间，低档速电磁搅拌下浸提3小时，过滤。浸出液用于测定，必要时，可进行稀释。如果试样的脂肪含量较高（如全脂大豆粗粉或豆粉），应在室温条件下先用戍烷：已烷（1：1）脱脂。脱脂方法如下：将试样浸泡于20ml戍烷：已烷（1：1）中，低档速电磁搅拌30min，过滤。残渣用约50ml戍烷：已烷（1：1）淋洗两次，收集残渣。然后进行浸提。7.2测定管和对照管的制备取两组平行的试管，按表1在每组试管中依次加入试样浸出液、水和胰蛋白酶溶液，于37℃水浴中混合后，再加入5.0mL预热至37℃的BAPA底物溶液，从第一管加入起计时，于37℃水浴中摇动混匀，并准确反应10min，最后加入1.0mL反应终止液。用0.45m微孔滤膜过滤，弃初始滤液,收集滤液。表1测定管反应体系单位为毫升试剂非抑管测定管1测定管2测定管3测定管4试样浸出液0.00.30.61.01.5水2.01.71.41.00.5胰蛋白酶溶液2.02.02.02.02.0BAPA底物溶液5.05.05.05.05.0反应终止液1.01.01.01.01.0在制备测定管的同时，应制备试剂对照管和试样对照管，即取2mL水或试样浸出液，然后按顺序加入2mL胰蛋白酶溶液、1mL反应终止液和5mLBAPA底物溶液，混匀后过滤。7.3测定以试剂对照管调节吸光度值为0，在410nm波长下测定各测定管和对照管的吸光度值，以平行试管的算术平均值表示。8结果表示8.1酶活性的表示方法8.1.1胰蛋白酶活性单位（TU）：在规定实验条件下，每10mL反应混合液在410nm波长下每分钟升高0.01吸光度值即为一个TU。8.1.2胰蛋白酶抑制率：在规定实验条件下，与非抑管相比，测定管吸光度值降低的比率。8.1.3胰蛋白酶抑制剂单位（TIU）：在规定实验条件下，与非抑管相比，每10mL反应混合液在410nm波长下每分钟降低0.01吸光度值即为一个TIU。8.2计算8.2.1各测定管的胰蛋白酶抑制率按式（1）计算。TIR=×100%……………………（1）AN－AT－AT0AN_____________________________________________________(0.001)(0.10)(0.5)式中：TIR－胰蛋白酶抑制率，％；AN－非抑管吸光度值；AT－测定管吸光度值；AT0－试样对照管吸光度值。8.2.2只有胰蛋白酶抑制率在20－70%范围内时，测定管吸光度值可用于胰蛋白酶抑制剂活性计算，各测定管胰蛋白酶抑制剂活性按式（2）计算。TI=…………………………………（2）式中：AN、AT、AT0同式（1）；TI－胰蛋白酶抑制剂活性，单位为胰蛋白酶抑制剂单位（TIU）；t－反应时间，单位为分钟（min）。8.2.3单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性以测定用试样浸出液体积（单位为mL）为横坐标，TI为纵坐标作图，拟和直线回归方程，计算斜率，斜率值即是单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性（单位为TIU/mL）。当测定用试样浸出液体积和TI不是一条直线关系时，单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性用各测定管单位体积胰蛋白酶抑制剂活性的算术平均值表示。8.2.4试样中胰蛋白酶抑制剂活性按式（3）计算。………TIM=…………………………………（3）式中：TIM－试样中胰蛋白抑制剂活性，单位为胰蛋白酶抑制剂单位每克（TIU/g）；TIV－单位体积试样浸出液中胰蛋白酶抑制剂活性，单位为胰蛋白酶抑制剂单位每毫升（TIU/mL）；V－试样浸出液总体积，单位为毫升（mL）；F－稀释倍数；m－试样质量，单位为克（g）。9允许差AN－AT－AT0t×0.01_____________________________________________________(0.001)(0.10)(0.5)TIV×V×Fm_____________________________________________________(0.001)(0.10)(0.5)重复条件下，两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的10％。