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-1-第36讲基因工程最新考纲高频考点核心素养1.基因工程的诞生(Ⅰ)2．基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3．基因工程的应用(Ⅱ)4．蛋白质工程(Ⅰ)5．DNA的粗提取与鉴定1.基因工程的工具与操作程序及应用2．蛋白质工程的操作1.生命观念——结构决定功能：基因的结构与功能2．科学思维——建立模型：基因工程的操作流程3．科学探究——解决问题：基因工程的应用和蛋白质工程考点1基因工程的操作工具1．基因工程的概念理解(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：无菌。(3)操作水平：DNA分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体生物体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物的遗传性状。2．限制性核酸内切酶(简称：限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)结果：产生黏性末端或平末端。-2-3．DNA连接酶(1)功能：缝合被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)类型常用类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能只“缝合”黏性末端“缝合”黏性末端和平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键4.载体(1)常用载体——质粒化学本质：双链环状DNA分子特点能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因(2)其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。(3)载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)1．切割质粒的限制性核酸内切酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(×)2．载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。(√)3．DNA连接酶能将两碱基间通过氢键连接起来。(×)4．限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(×)5．E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。(×)-3-6．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。(×)7．外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(×)8．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列。(×)9．用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(√)10．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。(×)11．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。(×)1．(选修3P6“寻根问底”改编)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。提示：不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。2．(选修3P6“旁栏思考题”)想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？提示：能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等。限制性核酸内切酶MunⅠ和限制性核酸内切酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。提示：适合的质粒是①。由图可知，质粒②上无标记基因，不适合作为载体；质粒③和④的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点，使用该酶后将会导致标记基因遭破坏，故均不宜选作载体。-4-●考向突破1限制性核酸内切酶、DNA连接酶等酶的作用1．(2020·江苏苏锡常镇四市高三调研)科学家尝试使用Cre/loxP位点特异性重组系统，在检测目的基因导入成功后，删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因。其技术过程如下(图中的■代表基因前的启动子)，据图回答下列问题：(1)loxP是一种只有34个碱基对构成的小型DNA片段，由两个13个碱基对反向重复序列和中间间隔的8个碱基对序列共同组成，自身不会表达，插入质粒后也不影响原有基因的表达，其碱基序列如下：Cre酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开loxP，其功能类似于基因工程中的限制酶。(2)将重组质粒导入植物细胞中最常用的方法是农杆菌转化法。作为标记基因，抗除草剂基因用于检测目的基因是否导入成功的原理是抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上，可以通过检测抗除草剂基因是否存在，从而判断目的基因是否导入成功。(3)经检测成功后，抗除草剂基因已没有用途，继续留在植物体内可能会造成的安全问题是抗除草剂基因可能转移到杂草中。经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开后，可得到如上图右侧的这两个DNA分子。由于除草剂基因前没有了启动子的原因，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。(4)loxP序列是有方向性的。如果经Cre酶处理后，发现抗除草剂基因反向连接在质粒一上，则原来质粒一中这两个loxP序列的方向是C。-5-A．两个都是正向B．两个都是反向C．一个正向一个反向D．与方向无关解析：(1)根据题意，Cre酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开loxP，其功能类似于基因工程中的限制酶。(2)由-6-于抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上，因此作为标记基因，可用于检测目的基因是否成功导入受体细胞。(3)抗除草剂基因留在植物体内可能转移到杂草中造成基因污染。经Cre酶处理后，抗除草剂基因前没有了启动子，抗除草剂基因在受体细胞内不再表达。(4)loxP序列是有方向性的。根据图示Cre酶处理后的结果，可知原来质粒一中这两个loxP序列一个正向一个反向，选C。整合提升归纳与DNA相关的六种酶名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到DNA单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到RNA单链末端●考向突破2载体的作用和特点分析2．(2020·福建龙岩一中实验班月考)如图所示为pBR322质粒，其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环素抗性基因)为标记基因，ori为复制原点，其他均为限制酶及其识别位点，并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载体。回答下列相关问题：-7-(1)制备重组质粒，需要限制酶和DNA连接酶。如制备重组质粒时，使用PvuⅠ切割该质粒，则检测目的基因是否导入受体细胞，需要在培养基中添加四环素。(2)该质粒中的BamHⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为，而Sau3AⅠ识别的核苷酸序列只有4个碱基。若BamHⅠ和Sau3AⅠ分别切割DNA所形成的DNA片段能拼接成一条DNA链，则Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及切割位点为。该拼接在一起的DNA片段，不一定(填“能”“否”或“不一定”)被BamHⅠ识别。(3)与图示质粒相比，完整的重组质粒中还应有启动子、终止子和目的基因等三种特殊的DNA片段。将重组质粒导入动、植物细胞的方法分别为显微注射法，农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法(后者答出一个即可)，如受体细胞为大肠杆菌，则该菌经钙离子处理后，具备将外界DNA吸入细胞的特性。解析：(1)基因工程所用的工具酶是限制酶和DNA连接酶。使用PvuⅠ切割pBR322质粒会破坏ampr(氨苄青霉素抗性基因)而tetr(四环素抗性基因)不受破坏所以可用含有四环素的培养基来筛选具有目的基因的细胞。(2)综合题目信息，可推知Sau3AⅠ识别的核苷酸序列及其切割位点为，这样Sau3AⅠ和BamHⅠ切割DNA时才能形成相同的黏性末端，进而能拼接成一条DNA链。重新拼接点的核苷酸序列不一定是—GGATCC—，因此不一定能被BamHⅠ识别，但一定能被Sau3AⅠ识别。(3)一个完整的重组质粒有标记基因、目的基因、启动子、终止子和复制原点等特殊片段。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法，而导入动物细胞的方法有显微注射法。钙离子处理后的大肠杆菌，将处于感受态，该状态的细胞具有将外界DNA吸入细胞的特性。-8-考点2基因工程的基本操作1．目的基因的获取(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。(2)方法从基因文库中获取人工合成利用mRNA反转录合成通过DNA合成仪用化学方法人工合成利用PCR技术扩增2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成(3)构建过程3．将目的基因导入受体细胞-9-4.目的基因的检测与鉴定判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)1．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达。(√)2．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株。(√)3．应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。-10-(×)如图为抗虫棉的培育过程，请据图回答下列问题：(1)该基因工程中的目的基因和载体分别是什么？一般情况下，为什么要用同一种限制酶处理目的基因和载体？(2)该实例中，采用何种方法导入目的基因？为什么目的基因可以整合到染色体的DNA上？(3)该实例中，检测目的基因是否成功表达的常见方法有哪两种？提示：(1)目的基因是Bt毒蛋白基因，载体是Ti质粒。用同一种限制酶处理目的基因和载体，可以获得相同的黏性末端，便于构建基因表达载体。(2)采用的方法是农杆菌转化法。由于Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞且能整合到受体细胞的染色体DNA上，而目的基因又插入到了T－DNA上，所以目的基因可以整合到受体细胞的染色体DNA上。(3)抗原—抗体杂交法、用棉叶饲喂棉铃虫。●考向突破基因工程的基本操作1．(2020·广东高三模拟)烟草易受烟草花叶病毒(TMV)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染，研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV烟草，操作流程如下图所示。请回答下列问题：-11-(1)过程①所用RNA可以从绞股蓝细胞的细胞质基质中获取。(2)过程②可以采用PCR(或多聚酶链式反应)技术获得大量目的基因，该技术的实质是双链DNA复制。(3)过程④最常用的方法是农杆菌转化法，该方法中需将目的基因插入受体细胞的染色体DNA上。(4)过程⑤所用到的培养基除了卡那霉素之外，还需要加入的特殊物质是植物激素(或生长素和细胞分裂素)。过程⑥还需要进行基因工程操作步骤中的目的基因的检测与鉴定，在分子水平上检验获得的烟草能否抗TMV的方法是抗原—抗体杂交法。解析：(1)根据题图分析可知，①表示逆转录过程，其模板RNA逆转录形成的DNA中含有目的基因(抗TMV基因)，因此该RNA可以从绞股蓝细胞的细胞质基质中提取。(2)过程②表示获取目的基因的过程，利用PCR技术可以大量扩增目的基因，PCR技术的原理是双链DNA的复制。(3)过程④表示将目的基因导入受体细胞的过程，将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，该方法可将目的基因插入到受体细胞的染色体DNA上。(4)过程⑤表示植物组织培养过程，此过程需要在培养基中加入植物激素，如细胞分裂素和生长素；过程⑥表示目的基因的检测与鉴定过程，对于产生的蛋白质可以采用抗原—抗体杂交法进行检验。2．(2020·湖北七市一模)基因工程是从分子水平对基因进行操作，从而实现人们定向改造生物，得到人们所需要的生物性状或生物产品的技术。目的基因的获取是基因工程的第一步，常见的方法是构建基因组文库。请分析并回答下列问题：(1)构建基因组文库的一般步骤：①提取某种生物体内的全部DNA或全部基因，用适当的限制酶处理，得到一定范围大小的DNA片段；②DNA片段分别与载体结合，得到重组载体