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-1-第35讲微生物的培养与应用最新考纲高频考点核心素养1.微生物的分离和培养2．某种微生物数量的测定3．培养基对微生物的选择作用4．利用微生物进行发酵来生产特定的产物以及微生物在其他方面的应用1.微生物的分离和培养2．培养基对微生物的选择作用1.科学思维——分析与综合：分析培养基的成分及其作用；比较与分类：平板划线法和稀释涂布平板法异同，选择培养基和鉴别培养基区别2．科学探究——设计实验探究微生物培养的条件3．社会责任——关注有害微生物的控制及宣传健康生活考点1培养基及微生物的纯化培养技术1．培养基(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。(3)分类固体培养基：含凝固剂液体培养基：不含凝固剂2．无菌技术的主要方法及适用对象[连一连]答案：a—Ⅲ—⑤a—Ⅴ—④a—Ⅵ—③b—Ⅰ—⑥b—Ⅱ—①b—Ⅳ—②3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基-2-4．纯化大肠杆菌(1)原理：在培养基上将细菌稀释或分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落-3-就是纯化的细菌菌落。(2)主要方法及纯化原理主要方法平板划线法稀释涂布平板法平板示意图纯化原理通过连续划线操作实现的将菌液进行一系列的梯度稀释和涂布平板操作实现的5.菌种的保藏方法(1)临时保藏法：对于频繁使用的菌种，先接种到试管的固体斜面培养基上培养，然后放入4℃的冰箱中保藏。(2)甘油管藏法：对于需要长期保存的菌种，先将菌液转入灭菌后的甘油中，混匀后放在－20℃冷冻箱中保存。判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)1．培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质。(√)2．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上。(×)3．消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。(√)4．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落。(×)5．用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落。(√)(选修1P18“旁栏小资料”改编)微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？提示：不是。微生物的接种方法还包括斜面接种、穿刺接种等。微生物接种的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。-4-如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析下列问题：(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是稀释涂布平板法、平板划线法。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌，为避免此种现象应当采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。(3)接种操作一定要在火焰附近进行是因为火焰附近存在着无菌区域。●考向突破1培养基及其制备方法和无菌技术的操作1．(2020·赣中南五校联考)回答下列有关微生物培养与运用的问题：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2gFeCl30.1gX1g维生素微量琼脂15g(1)如上表是筛选异养型细菌的培养基配方。从物理性质上看该培养基属于固体培养基，其中成分X除了为目的菌提供能源外，还能提供碳源和氮源。制备该培养基的一般操作顺序是计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。对培养基进行灭菌的常用方法是高压蒸汽灭菌法。(2)如图A、B是纯化微生物培养的两种接种方法，C、D是接种后培养的效果。某同学接种培养后获得图C所示效果，则其采用的接种方法是[B]稀释涂布平板法([]填“A”或“B”)；接种时可能的失误操作是涂布不均匀。-5-(3)微生物强化采油是利用某些微生物能降解石油、增大石油的乳化度、降低石油黏度的原理，通过向油井中注入含微生物的水来提高采油率的新技术。为筛选和纯化该类微生物，应向培养基中添加石油作为唯一碳源；培养一段时间后在培养基上形成降油圈，此时选取降油圈大的菌落就可获得高效菌株。解析：(1)题表中培养基的成分有凝固剂——琼脂，因此该培养基为固体培养基。培养基除应含有水、无机盐、特殊营养物质(维生素等)外，还应有碳源和氮源。制备固体培养基的一般操作顺序是计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。(2)图A运用接种环接种，表示的是平板划线法，相应培养效果如图D所示；图B运用涂布器接种，表示的是稀释涂布平板法，相应培养效果如图C所示。图C所示培养基上菌落分布不均匀，可能是接种过程中涂布不均匀所致。(3)筛选和纯化能降解石油的微生物时，应以石油为唯一碳源。降油圈越大，说明该处微生物降解石油的能力越强。整合提升1.培养基的配制原则(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。2．不同微生物对主要营养物质的需求特点(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。-6-●考向突破2微生物的纯化技术2．(2020·河北衡水中学调研)下列表格是某公司研发的一种培养大肠杆菌的培养基配方，请结合所学知识，回答下列相关问题：成分含量蛋白胨10.0g乳糖5.0g蔗糖5.0gK2HPO42.0g显色剂(伊红美蓝)0.2g琼脂12.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL(1)根据用途划分，该培养基属于鉴别培养基，若要分离能分解尿素的细菌，需对培养基作出的最关键的调整是将蛋白胨换成尿素，若还需鉴定分解尿素的细菌，需作出的调整是将伊红美蓝换成酚红。(2)从培养基的成分上看，大肠杆菌的同化类型为异养型。该培养基能否分离筛选出大肠杆菌？为什么？不能，原因是培养基中的碳源种类很多，可供多种微生物生存。(3)在实验室培养微生物时，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，紫外线可对空气进行灭菌的原因是紫外线能使蛋白质变性，还能破坏DNA的结构。(4)某同学尝试纯化大肠杆菌，其中一个平板的菌落分布如图所示，推测该同学接种时可能的操作失误是涂布不均匀。解析：(1)伊红美蓝是鉴定大肠杆菌的试剂，因此该培养基从用途上属于鉴别培养基；若要分离能分解尿素的细菌，则需要保证培养基中以尿素为唯一氮源，即将蛋白胨换成尿素；鉴定分解尿素的细菌，需要使用酚红指示剂。(2)大肠杆菌需要从培养基中获得碳源，因此其同化作用类型是异养型；由于表格中的培养基中的碳源种类很多，-7-可供多种微生物生存，因此该培养基不能分离筛选出大肠杆菌。(3)微生物培养时，关键是防止外来杂菌的感染；空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能让蛋白质变性，同时还能破坏DNA的结构。(4)由图可知，该同学采用的是稀释涂布平板法，但菌落比较集中，没有很好地分散开，可能是涂布不均匀导致的。整合提升两种纯化细菌的方法的比较比较项目平板划线法稀释涂布平板法图示关键操作接种环在固体培养基表面连续划线①一系列的梯度稀释②涂布平板法操作注意事项每次划线前后均需灼烧接种环稀释度要足够高，为确保实验成功可以增加稀释度的范围菌体获取在具有所需显著菌落特征的区域菌落中挑取菌体从适宜的稀释度的平板上的菌落中挑取菌体优点可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对微生物计数缺点不能对微生物计数操作复杂，需要涂布多个平板考点2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。-8-(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。2．实验流程(1)土壤取样→富含有机质的土壤表层土↓(2)样品的稀释→通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，适于计数的平板↓(3)接种→用稀释涂布平板法接种↓(4)培养细菌：30～37℃培养1～2天放线菌：25～28℃培养5～7天霉菌：25～28℃培养3～4天↓(5)观察→根据菌落的特征区分微生物↓(6)计数→统计菌落的数目↓(7)计算→根据公式“每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M[C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数]”进行计算3．分解尿素的细菌的鉴别(1)方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养分解尿素的细菌。(2)原理(3)实验现象及结论①培养基变红：该种细菌能分解尿素。-9-②培养基不变红：该种细菌不能分解尿素。4．设置对照和重复项目对照重复目的排除非测试因素对实验结果的影响排除偶然因素对实验结果的影响实例空白对照：确定培养基制作是否合格同一稀释度涂布至少3个平板判断正误(正确的打“√”，错误的打“×”)1．选择培养基可以鉴定某种微生物的种类。(×)2．对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法。(×)3．筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源。(√)4．分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低。(×)5．刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(×)(选修1P26“旁栏小资料”改编)细菌数目的测定还有哪些方法？举例说明。提示：滤膜法。测定饮用水中大肠杆菌的数目可以采用滤膜法。●考向突破1考查微生物的选择培养1．(2020·广东七校联合体高三联考)下面是筛选抗链霉素大肠杆菌的实验步骤及相关图解。-10-实验步骤：①把大量对链霉素敏感的大肠杆菌接种在不含链霉素的培养基1的表面，进行培养。②待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基2上，随即再影印到含有链霉素的培养基3上，进行培养。③在培养基3上出现了个别抗链霉素的菌落，将其挑选出。请回答下列问题：(1)配制培养基时除了满足基本的营养条件外，还需满足微生物生长对特殊营养物质、pH、氧气的要求。(2)从功能上看，含有链霉素的培养基属于选择培养基。若在培养基中加入伊红美蓝，则培养皿中长出的菌落颜色为黑色。由图可知，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。(3)对培养基2和3进行比较，在培养基2上找到与3上相应的菌落，挑取其中一个菌落接种到含链霉素(填“含链霉素”或“不含链霉素”)的培养基上，如果有较多的菌落出现，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前(填“前”或“后”)。(4)培养基3中的菌落比1、2中的菌落少很多，这说明基因突变具有低频性的特点。解析：(1)配制培养基时，在提供几种基本营养条件的基础上，还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。(2)链霉素是抗生素，对大肠杆菌具有选择作用。在伊红美蓝培养基上，大肠杆菌菌落颜色为黑色。由题图可知，1号培养基接种的方法为稀释涂布平板法。(3)培养基2和培养基3上相同的菌落，是具有相同性状的大肠杆菌形成的，将培养基2中一个相应菌落接种到含链霉素的培养基上，若出现较多的菌落，则说明该抗性基因突变发生在该菌接触链霉素之前。(4)抗链霉素性状是大肠杆菌基因突变后获得的性状，3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明基因突变具有低频性的特点。-11-●考向突破2微生物的分离与计数2．(2020·石家庄检测)资料一：瘤胃是反刍动物的第一胃，不同品种的反刍动物瘤胃内微生物的种类和数量不同，含细菌多的氮利用率高，含真菌多的碳利用率高。资料二：经研究发现，A品种牛瘤胃内容物每毫升细菌数为7.30×1010、真菌数为1.36×105；B品种牛瘤胃内容物每毫升细菌数为3.78×1010、真菌数为1.6×105。根据资料回答下列问题：(1)华北地区每年6月份都会产生大量的小麦秸秆，要得到