经口急性毒性试验.

实验二经口急性毒性试验AcuteOralToxicityTestDept.ofToxicologySchoolofPublicHealthXinjiangMedicalUniversity目的要求掌握实验动物的常用染毒途径和方法。掌握半数致死浓度的测定方法和结果评定。实习内容试验动物的选择和性别鉴定。试验动物的称重、编号以及随机分组方法。急性毒性试验常用染毒途径和方法。急性毒性反应的观察和LD50计算。实验材料(一)实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。(二)器材注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，10m1)、容量瓶(10，25，50ml、烧杯(10，25，50ml)、滴管、灌胃针(大鼠、小鼠适用)、电子天平(感应量1/10000g)、动物体重秤、外科剪刀、镊子。(三)试剂受试化学物为氟化钠(NaF，分析纯)，苦味酸酒精饱和液或其它染色剂。实验动物的选择(提问)实验动物的性别鉴定♀♂♀♂小鼠（Mouse）大鼠（Rat）实验动物的称重大、小鼠秤的感应量需在0.1g以下。同一组内、同性别动物体重差异应小于平均体重的10%。不同组间同性别动物体重均值差异应小于5%。急性毒性实验一般使用体重为18-22g的小鼠或/和180-220g大鼠。实验动物编号的标记方法颜料涂擦被毛编号法（常用于大小鼠）：红色：0.5%中性红或品红溶液黄色：3-5%苦味酸溶液（水）80-90%苦味酸酒精饱和溶液咖啡色：2%硝酸银黑色：煤焦油的酒精溶液大小鼠标记方法（单色法n10）单色法大小鼠标记方法（单色法n10）单色法标记原则：单色法编大于10的号码时，我们规定顺时针旋转，后一位必需大于前一位数，例如：可以编，12，13，14……19，但不能编10，11，20，21，22，30，31，32，33，等，以此类推。100以内最大能编89号。大小鼠标记方法（双色法n10）双色法大小鼠标记方法（双色法n10）红色表示十位数：头部染红色为10左前肢为20左腰部为30黄色表示个位数。其它标记方法烙印编号法：体内埋号编号法：耳孔编号法：挂牌编号法：表1动物随机分组表动物号123456789101112131415随机数字977424676242811457264253323732除6余数120120323205212分组ABFABFCBCBFEBAB动物号161718192021222324252627282930随机数字2773675124517989731676622766除6余数310130315144230分组CAFACFCAEADDBCF实验动物的随机分组规定：余数：1、2、3、4、5、6分别对应A、B、C、D、E、F组实验动物调配按上法分组后，A组有动物7只，B组7只，C组6只，D组与E组各2只，F组6只。为了使每组动物数均为5只，需要根据随机分配的原则再选出2只A组和1只C组动物给D组。B组选出2只，F组选出1只给E组。组别鼠号A141417192325B25810131528C7916202229D2627E1224F3611182130表2初步分组结果表3调配后30只动物随机分组组别鼠号组别鼠号A114171923D49252627B58101315E26122428C716202229F311182130具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的现有动物数，即：56/7(7为A组现动物数)整除，余数为0，将A组第7只动物(25号)调配给D组；下一个：50/6(6为A组现有动物数)余2，将A组第2只动物(4号)调配给D组；接下来26/6(6为C组现有动物数)余2，将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整分组成表3所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。实验动物染毒途径和方法（示教）常用的染毒途径：经口染毒经呼吸道染毒经皮染毒注射途径染毒吸收速率：静脉注射吸入染毒肌肉注射腹腔注射皮下注射经口染毒皮内注射其他染毒途径如经皮等食道气管ByLASCO面向自己,沿着门牙左边滑入食道气管ByLASCO面向自己,沿着门牙左边滑入受试物的配制1、受试化学物的量取(1)、称量法--固体化学物(2)、吸量法--液体化学物2、受试化学物的稀释(1)、等浓度稀释法(2)、等容量稀释法Karber法或平均致死量法，是依据剂量对数与死亡率呈S型曲线所包括的面积推导出死亡率为50%的剂量；此法简单，准确率高，但实验设计要求每个染毒组实验动物数相同，各计量组距呈等比级数，死亡率呈常态分布，最低剂量组死亡率20%，最高剂量组80%。寇氏法预实验目的是为了确定正式实验的剂量范围。一般是采用少量动物(2~3只为一组)，拉大组距，逐渐缩小，找出受试物0%和100%死亡剂量。正式试验经预试验求出受试化学物的致死剂量范围(即死亡率10%-90%的剂量范围)，再以下式求出正式试验的剂量组距(i)值。i—表示相邻的两个剂量组，剂量对数之差或相邻两组剂量比值的对数值；n—为设计的剂量组数；求得值后以最低剂量组的剂量值加上一个即是第二个剂量组的对数剂量，依次推至最高剂量组，查各自反对数及得出各组剂量的真实值。1-nlogLD10-logLD90i啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容（1）小鼠氟化钠经口急性毒性测量系统器官观察及检查项目中毒后一般表现中枢神经系统及神经肌肉系统植物神经系统呼吸系统行为动作对各种刺激的反应大脑及脊髓反射肌肉紧张力瞳孔大小分泌鼻孔呼吸性质和速率改变姿态、叫声异常、不安、安静震颤、运动失调、麻痹、惊撅、强制性动作易兴奋、被动、缺乏知觉、知觉过敏减弱、缺乏强直、弛缓扩大或缩小流泪、出汗流鼻涕弛缓、困难、潮式呼吸啮齿类动物急性毒性中毒主要观察内容（2）系统器官观察及检查项目中毒后一般表现泌尿生殖系统皮毛眼睛其他阴户、乳腺阴茎会阴部颜色、张力、完整性眼硷眼球透明度直肠或皮肤温度一般情况肿胀脱垂、遗精污秽、有分泌物皮肤充血、紫组、皮毛松弛、污秽上睑下垂突出，充血，震颤混浊降低、升高姿态不正常、消瘦小鼠氟化钠经口急性毒性测量表4急性毒性症状记录表受试物名称:实验日期:实验动物种系：结构式：室温：组别剂量(mg/m3)动物编号性别体重(g)症状出现时间死亡时间小鼠氟化钠经口急性毒性测量计算公式:LD50的计算—寇氏法其中：m:1ogLD50;Sm:标准差;Σp:各组死亡率总和;p:各组死亡率;q:1－pi：相邻两组对数值之差n：每组动物数;Xk：最大剂量的对数值(0.5)kmXipmpqSin表5某化学物质小鼠经口染毒死亡情况组别剂量动物数死亡数死亡率存活率p.qmg/kg对数（只）（只）（p）（q）1151.17611000102181.25611020.20.80.16321.71.33611050.50.50.25426.11.41611070.70.30.21531.31.49611090.90.10.09i=0.08Σp=2.3举例：LD50的计算——寇氏法0213.01009.021.025.016.008.03521.1)5.03.2(08.04961.1lg50mSLDlgLD50及其95%可信限为1.3521±1.96×0.0213＝1.3521±0.0417lgLD50及其95%可信区间范围为22.50mg/kg(20.44~24.76mg/kg)举例：LD50的计算——寇氏法外源化学物急性毒性分级（WHO）对人可能致死的估计量毒性分级大鼠一次经口LD50）（mg/kg）6只大鼠吸入4hr，死亡2～4只的浓度（ppm）兔经皮LD50(mg/kg)g/kg总量（g/60kg）剧毒11050.050.1高毒1～10～5～0.05～3中毒50～100～44～0.5～30低毒500～1000～350～5～250微毒5000～10000～2180～1510001mg/kg22.50mg/kg50mg/kg该化合物大鼠急性经口毒性为高毒举例：LD50的计算——寇氏法注意事项灌胃染毒时要求动物保持空腹状态，因此染毒前应禁食（不禁水）6～10小时。灌胃后至少2～3小时后才能喂食。油剂比水溶液要求限制喂食的时间更长些。相同剂量的受试物，若以不同浓度给药，死亡情况会有所不同。常用的方法是将受试物体积固定，根据实验设计的剂量将受试物配制成不同浓度的溶液进行灌胃。通常灌胃体积以体重的1%～2%计算，最多不超过3%，即每100g体重溜胃l～2m1，最多不超过3ml。根据实际经验得出的各种实验动物灌胃量的极限是：小鼠O.5～1ml，大鼠4～5m1。