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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２４２—２００８自然杀伤细胞活性试验犖犪狋狌狉犪犾犽犻犾犾犲狉犮犲犾犾犪犮狋犻狏犻狋狔犪狊狊犪狔２００８１１１８发布２００９０６０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由中国国家认证认可监督管理委员会归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准参加起草单位：中化化工标准化研究所、江南大学和天津市检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吕刚、张园、赵黎华、冯智劼、于智睿、赵琢。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２４２—２００８食品伙伴网自然杀伤细胞活性试验１ 范围本规范规定了自然杀伤细胞活性试验的测定方法、试验数据和评价。本规范适用于检测实验动物一次或多次接触化学物质后，对ＮＫ细胞活性的影响。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１４９２４．１ 实验动物 配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５ 实验动物 环境及设施３ 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１自然杀伤细胞 狀犪狋狌狉犪犾犽犻犾犾犲狉犮犲犾犾，犖犓在无抗原刺激下能够杀伤多种有核细胞的淋巴细胞，ＮＫ细胞是一种能表达“天然细胞毒作用”的独特细胞，ＮＫ细胞存在于血液和淋巴组织中，也存在于无胸腺个体的血液和淋巴组织中，它是抗自发性肿瘤细胞和病毒感染细胞的第一道防线，在免疫监视中起重要作用。４ 测定方法４．１ 乳酸脱氢酶（犔犇犎）测定法４．１．１ 材料及仪器靶细胞Ｋ５６２或ＹＡＣ１、Ｈａｎｋｓ液、ＲＰＭＩ１６４０培养液、青霉素、链霉素、谷胺酰胺、二巯基乙醇、乳酸锂或Ｌ乳酸钠、硝基氯化四氮唑（ＩＮＴ）、吩嗪二甲酯硫酸盐（ＰＭＳ）、氧化辅酶Ⅰ（ＮＡＤ）、０．２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液、可调微量加样器、９６孔平底板、ＣＯ２培养箱、酶标仪、ＬＤＨ基质液的配置见表１。表１ 犔犇犎基质液的配制试 剂浓度／（ｍｏｌ／Ｌ）乳酸锂５×１０－２硝基氯化四氮唑６．６×１０－４吩嗪二加酯硫酸盐２．８×１０－４氧化型辅酶１．３×１０－３ 将上述试剂溶于０．２ｍｏｌ／Ｌ的ＴｒｉｓＨＣｌ缓冲液（ｐＨ８．２）４．１．２ 操作方法４．１．２．１ 动物选择选择健康６周龄～８周龄，雌性ＣＢＡ、Ｃ３Ｈ或ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，试验前应在动物室适应７ｄ。试验动物的饲养和环境设施应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５。１犛犖／犜２２４２—２００８食品伙伴网４．１．２．２ 动物分组按随机方法将动物分为对照组及染毒组，各组动物１０只。４．１．２．３ 染毒染毒剂量，染毒组一般设为３个剂量组，高剂量为１／５ＬＤ５０～１／１０ＬＤ５０，低剂量以不引起任何免疫毒性，在低、高剂量中设中剂量组。组间距通常为５倍或２倍。４．１．３ 试验程序４．１．３．１ 靶细胞制备试验前２４ｈ将靶细胞（Ｋ５６２或ＹＡＣ１细胞）进行传代培养，用以前Ｈａｎｋｓ液洗三次，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，悬浮在一定体积的Ｈａｎｋｓ液中，计数细胞，用ＲＰＭＩ１６４０完全培养液调整细胞浓度为１×１０５／ｍＬ。４．１．３．２ 效应细胞的制备———经染毒后，将各组动物包括对照组用颈椎脱臼法处死小鼠，取出脾脏，制备脾细胞悬液，整个操作在４℃下进行，以保持ＮＫ细胞的活性；———离心１０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，在４℃下进行；———弃上清液，将细胞悬浮在５ｍＬ冷的ＲＰＭＩ１６４０完全培养液中；———计数细胞并检查细胞的活力（台酚蓝拒染法）；———用ＲＰＭＩ１６４０完全培养液调整细胞浓度，如效应细胞与靶细胞之比按１∶５０，则效应细胞浓度为５×１０６／ｍＬ。４．１．３．３ 犖犓细胞活性检测———取靶细胞和效应细胞各１００μＬ，加入Ｕ型９６孔培养板中；靶细胞自然释放孔，加靶细胞和１％ＮＰ各１００μＬ，上述各项均设３个复孔；———将培养板置３７℃、５％ＣＯ２培养箱中培养４ｈ～６ｈ；———将培养板在水平离心机上，１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；———每孔吸取上清液１００μＬ，置于９６孔平底培养板中，同时加入ＬＤＨ基质液１００μＬ，反应３ｍｉｎ。每孔加入１ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ３０μＬ，立即在酶标仪４９０ｎｍ处测定犗犇值。４．１．３．４ 结果计算结果计算见式（１）：ＮＫ细胞活性（％）＝批应孔犗犇－靶细胞自然释放孔犗犇最大释放孔犗犇－靶细胞自然释放孔犗犇×１００％………（１）４．２ 同位素５１犆狉释放法４．２．１ 材料和仪器靶细胞Ｋ５６２或ＹＡＣ１、Ｈａｎｋｓ液、ＲＰＭＩ１６４０培养液、效应小鼠脾淋巴细胞、Ｎａ２５１ＣｒＯ４比活性（３．７～５．５）×１０６Ｂｑ，放射强度为（３．７～７．４）×１０７Ｂｑ，９６孔培养板（Ｕ型），γ测定仪，可调微量加样器和二氧化碳培养箱。４．２．２ 操作方法同４．１．２。４．２．３ 试验程序４．２．３．１ 靶细胞标记———将靶细胞（Ｋ５６２或ＹＡＣ１）进行传代，２４ｈ后用台酚蓝拒染法检测细胞活力，细胞活力应≥９５％；———细胞悬浮在ＲＰＭＩ１６４０完全培养液中，计数细胞，将细胞用ＲＰＭＩ１６４０完全培养液调整成４×１０６／ｍＬ；———将调整好的细胞与Ｎａ２５１ＣｒＯ４充分混合，置３７℃含５％ＣＯ２温箱培养４５ｍｉｎ～６０ｍｉｎ；２犛犖／犜２２４２—２００８食品伙伴网———用Ｈａｎｋｓ液洗３次，１０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ；———计数细胞并用ＲＰＭＩ１６４０完全培养液调细胞浓度为１×１０５／ｍＬ。４．２．３．２ 效应细胞的制备同４．１．３．２。４．２．３．３ 犖犓细胞活性检测———将效应细胞分装到９６孔Ｕ型培养板中，１００μＬ／孔，并加入靶细胞１００μＬ／孔，使效靶之比为１００∶１，５０∶１，２５∶１，同时设５１Ｃｒ标记靶细胞最大释放孔，靶细胞和１％ＮＰ各１００μＬ／孔。上述各项均设３个复孔。———在３７℃含５％二氧化碳的培养箱中培养４ｈ～６ｈ。———离心后，每孔取上清液２００μＬ，放入测定管中。———在γ计数仪上测定犆犘犕。４．２．３．４ 计算结果结果计算见式（２）：ＮＫ细胞活性（％）＝（效应细胞＋靶细胞）自然释放孔犆犘犕最大释放孔犆犘犕－自然释放孔犆犘犕×１００％…………（２）５ 试验数据以表格方式列出每只动物编号、性别，（效应细胞＋靶细胞）孔犗犇值或犆犘犕值，自然释放孔的犗犇值或犆犘犕值及最大释放孔的犗犇值或犆犘犕值，通过公式计算ＮＫ细胞活性。６ 试验记录———试验开始、结束时间，实验室名称，试验负责人及参加试验者；———动物品、系、来源、饲养条件，动物室环境；———受试物的理化性质及配置方法，染毒时间，染毒途径；———靶细胞来源、保存、传代及制备方法；———动物处死时间及方法；———动物开始时体重，结束时体重；———根据测定的犗犇值或犆犘犕值，计算ＮＫ细胞活性；———统计分析方法；———结果评价。７ 评价及解释外源化学物对动物ＮＫ细胞活性的影响，多数能引起人体ＮＫ细胞活性的变化，但需要人ＮＫ细胞活性检测加以证实。犛犖／犜２２４２—２００８食品伙伴网