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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２０６．３—２００９化妆品微生物检验方法第３部分：肺炎克雷伯氏菌犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犻狀犮狅狊犿犲狋犻犮狊—犘犪狉狋３：犓犾犲犫狊犻犲犾犾犪狆狀犲狌犿狅狀犻犪犲２００９０２２０发布２００９０９０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２２０６《化妆品微生物检验方法》分为以下部分：———第１部分：沙门氏菌；———第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；———第３部分：肺炎克雷伯氏菌；———第４部分：链球菌；———第５部分：肠球菌。本部分为ＳＮ／Ｔ２２０６的第３部分。本部分的附录Ａ为规范性附录。本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本部分主要起草人：许龙岩、胡科锋、刘静宇、易敏英、杨捷林、翁文川、凌莉、阳静、袁幕云、陈碧玲。本部分系首次发布的出入境检验检疫标准。Ⅰ犛犖／犜２２０６．３—２００９化妆品微生物检验方法第３部分：肺炎克雷伯氏菌１ 范围ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分规定了化妆品中肺炎克雷伯氏菌的检验方法。本部分适用于化妆品中肺炎克雷伯氏菌的检验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ７９１８．１ 化妆品微生物标准检验方法 总则３ 材料和设备３．１ 吸管：２．０ｍＬ和１０．０ｍＬ，分刻度０．１ｍＬ。３．２ 三角瓶：１５０ｍＬ，２５０ｍＬ。３．３ 培养皿：直径９０ｍｍ。３．４ 接种针、接种环。３．５ 载玻片。３．６ 样品处理器具：镊子、剪刀、勺子。３．７ 天平：０ｇ～６００ｇ，感量０．１ｇ。３．８ 均质器：转速１０００ｒ／ｍｉｎ以上。３．９ 恒温培养箱：３６℃±１℃。３．１０ 高压灭菌器。３．１１ ＶＩＴＥＫ全自动微生物鉴定系统或类似设备。注：ＶＩＴＥＫ是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的唯一认可。如果其他等效产品具有相同的效果，也可使用这些等效产品。４ 培养基和试剂４．１ ０．８５％生理盐水。４．２ ＳＣＤＬＰ液体培养基（见附录Ａ中第Ａ．１章）。４．３ 胆硫乳琼脂（ＤＨＬ）（见附录Ａ中第Ａ．２章）。４．４ 营养琼脂斜面培养基（见附录Ａ中第Ａ．３章）。４．５ 动力半固体琼脂（见附录Ａ中第Ａ．４章）。４．６ 氧化酶试剂（见附录Ａ中第Ａ．５章）。４．７ ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定试剂条或其他等效产品。注：ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定试剂条是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的唯一认可。如果其他等效产品具有相同的效果，也可使用这些等效产品。１犛犖／犜２２０６．３—２００９４．８ ＧＮ测试卡。注：ＧＮ测试卡是由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的唯一认可。如果其他等效产品具有相同的效果，也可使用这些等效产品。５ 方法提要化妆品中肺炎克雷伯氏菌检验方法是通过增菌、分离、生化鉴定对化妆品中可能存在的肺炎克雷伯氏菌进行定性检验。６ 检验程序肺炎克雷伯氏菌检验程序见图１。图１７ 样品制备化妆品中不同类型的检样制备参照ＧＢ／Ｔ７９１８．１进行制样。８ 操作步骤８．１ 取１∶１０样品稀释液１０ｍＬ接种到９０ｍＬＳＣＤＬＰ液体培养基中，置３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。８．２ 自上述培养液中，取（１～２）接种环，划线接种于胆硫乳琼脂平板（ＤＨＬ）中，置３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。在ＤＨＬ平板上肺炎克雷伯氏菌菌落呈淡粉红色，大而隆起，光滑湿润，粘液状，相邻菌落容易融合成脓汁样，接种针挑取菌落时呈丝状粘连。８．３ 从ＤＨＬ平板上至少挑取５个典型或可疑菌落，如果平板上可疑菌落少于５个，则全部挑取，把挑取的可疑菌落分别穿刺于动力半固体琼脂，并接种到营养琼脂斜面培养基，３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ。８．４ 将８．３中营养琼脂斜面培养基上的纯培养物做革兰氏染色、氧化酶试验。无动力，革兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性者，用ＡＰＩ２０Ｅ生化鉴定试剂条或ＶＩＴＥＫ生化鉴定系统进行生化鉴定，或按表１进行生化试验。２犛犖／犜２２０６．３—２００９表１ 肺炎克雷伯氏菌生化特性试验项目肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种尿素酶＋ｄ－靛基质－－－ＭＲ－／＋＋＋ＶＰ＋－－西蒙氏枸橼酸盐＋ｄ－Ｄ酒石酸盐＋／－－／＋－丙二酸盐＋－＋ＯＮＰＧ＋＋－赖氨酸脱羧酶＋ｄ－分解葡萄糖产气＋ｄ－乳糖＋ｄ－卫矛醇－／＋－－ 注：“＋”≥９０％阳性，“＋／－”７５８８％阳性，“ｄ”为不定，“－／＋”７５８９％阴性，“－”≥９０％阴性。９ 结果报告根据生化鉴定结果报告样品中检出或未检出肺炎克雷伯氏菌。３犛犖／犜２２０６．３—２００９附 录 犃（规范性附录）培养基和试剂犃．１ 犛犆犇犔犘液体培养基成分：酪蛋白胨 １７．０ｇ大豆蛋白胨３．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸氢二钾２．５ｇ葡萄糖２．５ｇ卵磷脂１．０ｇ吐温８０７．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ制法：将卵磷脂在４００ｍＬ蒸馏水中加热至完全溶解，再将其他成分混合加入６００ｍＬ蒸馏水中，加热完全溶解。将上述两种溶液混合后，充分搅拌均匀。调ｐＨ为７．２～７．３分装，１２１℃２０ｍｉｎ高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温８０充分混合，待冷却至２５℃左右使用。犃．２ 胆硫乳琼脂（犇犎犔）成分：蛋白胨２０．０ｇ牛肉膏３．０ｇ乳糖１０．０ｇ蔗糖１０．０ｇ牛胆盐１．０ｇ硫代硫酸钠２．２ｇ柠檬酸钠１．０ｇ柠檬酸铁铵１．０ｇ中性红０．０３ｇ或５ｇ／Ｌ水溶液６ｍＬ琼脂１８．０ｇ～２０．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ制法：除中性红和琼脂外，将其他成分加入４００ｍＬ蒸馏水中，搅拌均匀，静置约１０ｍｉｎ，加热煮沸至完全溶解，调ｐＨ为７．３±０．１，再将琼脂加入６００ｍＬ蒸馏水中，搅拌均匀，静置约１０ｍｉｎ，加热煮沸至完全溶解。将两种溶液混合后，再加入５ｇ／Ｌ中性红水溶液６ｍＬ，搅拌均匀，待冷却至５０℃～５５℃，倾注平皿备用。犃．３ 营养琼脂斜面培养基成分：蛋白胨１０．０ｇ牛肉膏３．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ制法：除琼脂外，将其余成分溶解于蒸馏水中，ｐＨ为７．２～７．４，加入琼脂，加热溶解，分装试管，４犛犖／犜２２０６．３—２００９１２１℃１５ｍｉｎ高压灭菌后，制成斜面备用。犃．４ 动力半固体琼脂成分：胰蛋白胨１０．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ制法：将各成分加入蒸馏水中，加热溶解，调节ｐＨ至７．３±０．１，分装１５ｍｍ×１００ｍｍ试管，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，制成半固体高层。犃．５ 氧化酶试验试剂成分：四甲基对苯二胺１．０ｇ蒸馏水１００ｍＬ制法：将四甲基对苯二胺溶于蒸馏水即可，现用现配。若装入棕色瓶中，放置于２℃～８℃冰箱保存，可在配制后７ｄ内使用。５犛犖／犜２２０６．３—２００９书书书９００２—３．６０２２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准化妆品微生物检验方法第３部分：肺炎克雷伯氏菌ＳＮ／Ｔ２２０６．３—２００９中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数９千字２００９年５月第一版 ２００９年５月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１９６４８ 定价１６．００元