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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１２５—２００８李痘病毒检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犾狌犿狆狅狓狏犻狉狌狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈定虎、王章根、李明福、胡学难、李桂芬、王秀芬、冯黎霞、管维。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１２５—２００８李痘病毒检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了李痘病毒检疫和鉴定的基本原则和方法。本标准适用于带有李痘病毒的所有进出境的无性繁殖材料、组培苗、种子和果实的检疫鉴定。２ 原理李痘病毒学名：Ｐｌｕｍｐｏｘｖｉｒｕｓ（ＰＰＶ），别名：Ｓｈａｒｋａｖｉｒｕｓ，是核果类果树危险性最大的病毒之一，其外壳蛋白的特异性和核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、地理分布、寄主范围和症状、传播途径、血清学特性及基因组特征等参见附录Ａ。３ 仪器设备、用具及试剂３．１ 仪器设备３．１．１ 酶标检测仪。３．１．２ ＰＣＲ扩增仪。３．１．３ 电泳仪。３．１．４ 台式高速冷冻离心机。３．１．５ 凝胶成像系统。３．１．６ 电子分析天平。３．２ 用具３．２．１ 移液器（０．１μＬ～２μＬ，２μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）。３．２．２ 研钵。３．２．３ ０．２ｍＬ、０．５ｍＬ、１．５ｍＬ离心管。３．２．４ 酶联板。３．３ 犈犔犐犛犃检测试剂３．３．１ 包被缓冲液１０００犿犔（狆犎９．６）碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３） １．５９ｇ碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ溶于１０００ｍＬ蒸馏水中，溶液的ｐＨ为９．６，不需要调ｐＨ值。３．３．２ 犘犅犛缓冲液１０００犿犔（狆犎７．２～７．４）氯化钠（ＮａＣｌ） ８ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ）２．９ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ用无菌水溶解并定容至１０００ｍＬ。３．３．３ 样品抽提缓冲液１０００犿犔二乙基碳酰二胺（ＤＩＥＣＡ） ２．０ｇＰＶＰ１０２０．０ｇ１犛犖／犜２１２５—２００８用ＰＢＳ缓冲液（ｐＨ７．２～７．４）溶解并定容至１０００ｍＬ。３．３．４ 洗涤缓冲液１０００犿犔吐温２０ ０．５ｍＬＰＢＳ缓冲液５００ｍＬ无菌水５００ｍＬ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ３．３．５ 抗体稀释缓冲液１×ＰＢＳ缓冲液０．５％牛血清白蛋白（ＢＳＡ）３．３．６ 底物缓冲液（狆犎９．８）１０００犿犔二乙醇胺 ９７ｍＬ加蒸馏水８００ｍＬ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ用盐酸（ＨＣｌ）调ｐＨ至９．８，然后定容至１０００ｍＬ。３．３．７ 底物溶液在底物缓冲液中加入碱性磷酸酶的底物对硝基苯磷酸钠（狆ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌＰｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＮＰＰ），浓度为１ｍｇ／ｍＬ。３．４ 犘犆犚检测试剂３．４．１ 犚犖犃抽提缓冲液２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０１％ＳＤＳ，０．２％β巯基乙醇３．４．２ 犜犈 缓冲液１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０３．４．３ 犜犃犈 缓冲液４０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＡｃ１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０３．４．４ ６×加样缓冲液溴酚蓝 ０．２５％３．４．５ 引物合成根据已报道的ＰＰＶ以及其Ｄ株系和Ｍ株系的保守序列设计通用和特异性引物：ＰＰＶ通用引物：Ｐｒｉｍｅｒ１：５’ａｃｃｇａｇａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃｃｃ３’Ｐｒｉｍｅｒ２：５’ｃａｇａｃｔａｃａｇｃｃｔｃｇｃｃａｇａ３’ＰＰＶ特异性引物：Ｄ株系：Ｐｒｉｍｅｒ１：５’ａｃｃｇａｇａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃｃｃ３’ＰＤ：５’ｃｔｔｃａａｃｇａｃａｃｃｃｇｔａｃｇｇ３’Ｍ株系：Ｐｒｉｍｅｒ１：５’ａｃｃｇａｇａｃｃａｃｔａｃａｃｔｃｃｃ３’ＰＭ：５’ｃｔｔｃａａｃａａｃｇｃｃｔｇｔｇｃｇｔ３’２犛犖／犜２１２５—２００８４ 检验方法４．１ 症状检查要仔细检查李属科植物叶片及其花、果实及种子是否有畸形、环斑、斑驳等可疑症状并采集可疑症状的样品。４．２ 血清学检测对采集的植物样品采用三抗夹心免疫吸附测定法（ＴＡＳＥＬＩＳＡ）进行检测。ａ） 采取５０ｍｇ表现可疑症状的植物组织，同时用５０ｍｇ健康组织和组织提取缓冲液作为阴性对照，加入２５０μＬ样品抽提缓冲液研磨制成待测样品液；ｂ） 用包被缓冲液按要求稀释多克隆兔抗ＰＰＶ抗体，然后在酶联板的加样孔中加入９０μＬ该稀释抗体，３７℃保温４ｈ；ｃ） 然后用洗涤缓冲液洗涤酶联板３次，每孔加入洗涤缓冲液３００μＬ，每次５ｍｉｎ；ｄ） 取待测样品液９０μＬ加入酶联板的加样孔中（以健康组织和植物组织抽提缓冲液作为阴性对照），４℃保温过夜（约８ｈ）；ｅ） 用洗涤缓冲液洗涤酶联板３次，每孔加入洗涤缓冲液３００μＬ，每次５ｍｉｎ；ｆ） 每孔加入９０μＬ合适稀释的第二抗体（单克隆ＰＰＶ抗体），３７℃孵育２ｈ；ｇ） 用洗涤缓冲液洗涤酶联板３次，每孔加入洗涤缓冲液３００μＬ，每次５ｍｉｎ；ｈ） 每孔加入９０μＬ合适稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，３７℃孵育２ｈ；ｉ） 用洗涤缓冲液洗涤酶联板３次，每孔加入洗涤缓冲液３００μＬ，每次５ｍｉｎ；ｊ） 每孔加入新配制的底物溶液９０μＬ，然后在不同的时间分别测定它们的ＯＤ４０５ｎｍ吸收值。４．３ 植物组织总犚犖犃提取４．３．１ 选取０．１ｇ表现可疑症状的植物组织，同时用０．１ｇ健康组织作为对照。将植物组织加液氮冷冻后充分研磨后装入１．５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ离心管中。４．３．２ 在离心管中加入冰冷的４００μＬＲＮＡ抽提液，颠倒混合均匀。４．３．３ 台式冷冻离心机４℃１２０００犵离心１０ｍｉｎ。４．３．４ 取上清液，加入４００μＬ苯酚三氯甲烷异戊醇（２５∶２４∶１，体积比），颠倒混合均匀。４．３．５ 台式冷冻离心机４℃１２０００犵离心１０ｍｉｎ。４．３．６ 取上清液，加入４００μＬ三氯甲烷异戊醇（２４∶１，体积比），颠倒混合均匀。４．３．７ 台式冷冻离心机４℃１２０００犵离心１０ｍｉｎ。４．３．８ 取上清液，加入１０００μＬ无水乙醇和４０μＬ３ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠ｐＨ５．２，颠倒混合均匀。４．３．９ 台式冷冻离心机４℃１２０００犵离心１０ｍｉｎ。４．３．１０ 留沉淀，用５００μＬ７０％冷乙醇洗涤一次，置于超净工作台上吹干，然后溶于２０μＬ无ＲＮＡ酶的水中。４．４ 犚犜犘犆犚检测４．４．１ ＲＴ：在０．５ｍＬ离心管中加入去离子水９．５μＬ，加入总ＲＮＡ２μＬ，ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５０．５μＬ（０．５μｇ），ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，７０℃水浴５ｍｉｎ后立即置于冰上２ｍｉｎ；然后３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ；再加入５×ｃＤＮＡ第一链合成缓冲液４μＬ，０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ１μＬ；ＲＮａｓｅ抑制剂１μＬ（３０Ｕ）；ＭＭＬＶ反转录酶１μＬ（２０Ｕ）；３７℃６０ｍｉｎ。４．４．２ ＰＣＲ扩增：在０．２ｍＬ离心管中加入１０×ＰＣＲ扩增缓冲液２．５μＬ，氯化镁（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ，ｄＮＴＰｓ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，Ｐｒｉｍｅｒ１１μｍｏｌ／Ｌ（５０ｐｍｏｌ），Ｐｒｉｍｅｒ２１μｍｏｌ／Ｌ（５０ｐｍｏｌ）或ＰＤ（５０ｐｍｏｌ）或ＰＭ（５０ｐｍｏｌ），ｃＤＮＡ第一链合成反应液２μＬ，加水至２５μＬ，然后加入犜犪狇聚合酶０．５μＬ（１Ｕ）。ＰＣＲ循环条件：９４℃变性３ｍｉｎ；然后９４℃４０ｓ，６０℃４０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，循环４０次；最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；４℃保存反应产物。以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照，ＰＰＶＲＮＡ为阳性对照。３犛犖／犜２１２５—２００８４．５ 琼脂糖电泳４．５．１ 用１×ＴＡＥ缓冲液和琼脂糖按１．５％的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至５５℃左右。４．５．２ 加入ＳＹＢＲ?ＧＲＥＥＮⅠ核酸染料或溴化乙锭（１μｇ／ｍＬ），混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳。４．５．３ 待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的ＴＡＥ缓冲液（缓冲液没过凝胶上表面约１ｍｍ）。４．５．４ 取１μＬ加样缓冲液与５μＬＰＣＲ反应液混合均匀，然后分别将其和合适的ＤＮＡ分子量标准物加入样品孔中。４．５．５ 接通电源进行电泳，电压５Ｖ／ｃｍ。４．５．６ 当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离ＤＮＡ片段时，停止电泳。４．５．７ 将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照相记录。５ 结果判断５．１ 血清学结果判断５．１．１ 对照孔的ＯＤ４０５值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的ＯＤ４０５值小于０．１５，当阴性对照孔的ＯＤ４０５值小于０．０５时，按０．０５计算；阳性对照ＯＤ４０５值／阴性对照ＯＤ４０５值大于５。５．１．２ 在满足了５．１．１质量要求后，结果判断如下：样品ＯＤ４０５值／阴性对照ＯＤ４０５值大于等于２，判为阳性；样品ＯＤ４０５值／阴性对照ＯＤ４０５值小于２，判为阴性。５．１．３ 若满足不了５．１．１质量要求，则不能进行结果判断。５．１．４ 如果是商品试剂盒，则根据试剂盒的说明来判断。５．２ 犘犆犚 结果判断５．２．１ 当琼脂糖电泳时，如果阳性对照和待测样品都出现２４３ｂｐＤＮＡ特异性条带而阴性对照没有该条带，即可判定该样品带有李痘病毒，否则不带有李痘病毒。５．２．２ 对于带有李痘病毒的样品，如果用Ｐｒｉｍｅｒ１和ＰＤ二引物扩增出１９８ｂｐＤＮＡ条带，则说明该李痘病毒为Ｄ株系；当用Ｐｒｉｍｅｒ１和ＰＭ扩增出１９８ｂｐＤＮＡ条带，则说明该李痘病毒为Ｍ株系。６ 样品保存与复核６．１ 样品保存检测为阳性的植物样品，经液氮冷冻后，于－８０℃下保存。保存样品做好登记和标记工作。６．２ 结果记录与资料保存包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签字。ＥＬＩＳＡ要有实验数据结果，ＰＣＲ要有电泳检测阳性结果照片。６．３ 复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责，主要考察实验原始数据记录及其电泳照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。４犛犖／犜２１２５—２００８附 录 犃（资料性附录）李痘病毒介绍犃．１ 李痘病毒分类地位马铃薯Ｙ病毒科（Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ），马铃薯Ｙ病毒属（犘狅狋狔狏犻狉狌狊）。犃．２ 地理分布保加利亚、罗马尼亚、阿尔巴尼亚、塞浦路斯、法国、德国、希腊、匈牙利、意大利、卢森堡、波兰、葡萄牙、西班牙、叙利亚、土耳其、英国、俄罗斯、埃及、智利及美国、加拿大、澳大利亚等国家。犃．３ 寄主范围ＰＰＶ能侵染木本科和草本科寄主。李属植物是其自然寄主，最主要的自然寄主是刺李（犘狉狌狀狌狊狊狆犻狀狅狊犪），其他如杏（犘狉狌狀狌狊犪狉犿犲狀犻犪犮犪Ｌ．）、桃（犘．狆犲狉狊犻犮犪Ｌ．）和日本的李子（犘．犱狅犿犲狊狋犻犮犪Ｌ．）以及甜樱桃（犘．犪狏犻狌犿Ｌ．）和酸樱桃（犘．犮犲狉犪狊狌狊Ｌ．）。菊叶香藜（犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犳狅犲狋犻犱狌犿）和克利夫兰烟（犖犻犮狅狋犻犪狀犪犮犾犲狏犲狉犾犪狀犱犻犻）通常作为草本指示植物。犃．４ 寄主症状犃．４．１ 刺李（犘狉狌狀狌狊狊狆犻狀狅狊犪）和日本的李子（犘．犱狅犿犲狊狋犻犮犪Ｌ．）：叶片上出现严重的扩散淡绿环或斑驳，果皮上出现深色的环，果肉出现红色或淡红色，果核带棕色斑点，大约有９０％果实在未成熟前落果。犃．４．２ 桃（犘狉狌狀狌狊狆犲狉狊犻犮犪）、甜樱桃（犘．犪狏犻狌犿Ｌ．）和酸樱桃（犘．犮犲狉犪狊狌狊Ｌ．）：叶片出现黄化叶脉、褪绿斑点和畸形，果皮出现散布的淡黄色斑点。犃．４．３ 杏（犘狉狌狀狌狊犪狉犿犲狀犻犪犮犪）：叶片出现散布的暗绿色斑和线，果实变形，果皮散