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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１０２．２—２００８／犐犛犗／犜犛２０８３６：２００５食源性病原体犘犆犚检测技术规范第２部分：犘犆犚仪性能试验要求犘狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀（犘犆犚）犳狅狉狋犺犲犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犳狅狅犱犫狅狉狀犲狆犪狋犺狅犵犲狀狊—犘犪狉狋２：犘犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲狋犲狊狋犻狀犵犳狅狉狋犺犲狉犿犪犾犮狔犮犾犲狉狊［ＩＳＯ／ＴＳ２０８３６：２００５，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｏｆｆｏｏｄａｎｄａｎｉｍａｌｆｅｅｄｉｎｇｓｔｕｆｆｓ—Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｆｏｏｄｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎｓ—Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｔｅｓｔｉｎｇｆｏｒｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒｓ，ＩＤＴ］２００８０７１７发布２００９０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２１０２：《食源性病原体ＰＣＲ检测技术规范》共分为四个部分：———第１部分：通用要求和定义；———第２部分：ＰＣＲ仪性能试验要求；———第３部分：定性检测方法样品制备要求；———第４部分：定性检测方法ＰＣＲ扩增要求。本部分为ＳＮ／Ｔ２１０２的第２部分。本部分等同采用ＩＳＯ／ＴＳ２０８３６：２００５《食品与动物饲料微生物学 食源性病原体ＰＣＲ检测 ＰＣＲ仪性能试验要求》，并做了如下编辑性修改：———对“前言”和“引言”进行了修改；———对“规范性引用文件”的描述按照ＧＢ／Ｔ１．１的要求进行了修改；———将标准中的国际标准用相应的国家标准或行业标准替代，如：ＧＢ／Ｔ２７０２５代替ＩＳＯ１７０２５；———将第Ａ．３章中试剂浓度的表述方式改为中文表述方式；———将“警告”改为“安全要求，并放置到标准的末尾段；———删除了标准后的参考文献。本部分的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分由中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山西出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局负责起草。本部分主要起草人：李卫华、赵贵明、李晓虹、王振国、许龙岩、雷质文、邹明强、刘守贤。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１０２．２—２００８／犐犛犗／犜犛２０８３６：２００５引 言 聚合酶链式反应（ＰＣＲ）具有快速、灵敏和特异的优点，利用ＰＣＲ技术进行食源性微生物的检测方法近年来发展十分迅速。目前，ＰＣＲ仪在技术方面已十分完善，但因受珀耳帖效应及制作工艺的影响，加热、冷却元器件具有一定的使用寿命，这些元器件的正常功能取决于其本身质量以及正确的使用与维护。为此，进行ＰＣＲ仪的日常维护仍十分必要。ＩＳＯ／ＴＳ２０８３６：２００５，由欧洲标准委员会（ＣＥＮ）食品分析 水平方法技术委员会（ＣＥＮ／ＴＣ２７５）与食物产品技术委员会（ＩＳＯ／ＴＣ３４）微生物小组委员会（ＳＣ９）依照ＩＳＯ和ＣＥＮ技术合作协议联合制定。本部分等同采用ＩＳＯ／ＴＳ２０８３６：２００５，为《食源性病原体ＰＣＲ检测技术规范》的第２部分。规定了ＰＣＲ仪（包括制冷／加热元件）安装、使用与维护的一般原则。资料性附录Ａ和附录Ｂ中规定了ＰＣＲ仪性能试验的生化和物理方法。Ⅱ犛犖／犜２１０２．２—２００８／犐犛犗／犜犛２０８３６：２００５食源性病原体犘犆犚检测技术规范第２部分：犘犆犚仪性能试验要求１ 范围ＳＮ／Ｔ２１０２的本部分确立了ＰＣＲ仪的安装、使用、维护的基本要求，规定了ＰＣＲ仪性能试验的生化和物理方法。ＰＣＲ仪的制冷／加热元件都有规定的使用寿命，其正常功能的发挥不仅取决于设计的质量，也取决于正确的使用和维护。本部分适用于ＰＣＲ仪的生化和物理性能试验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２１０２的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ２７０２５ 检测和校准实验室能力的通用要求ＳＮ／Ｔ２１０２．１ 食源性病原体ＰＣＲ检测技术规范 第１部分：通用要求和定义３ 术语和定义ＳＮ／Ｔ２１０２．１确立的以及下列术语和定义适用于ＳＮ／Ｔ２１０２的本部分。３．１热盖 犺犲犪狋犾犻犱ＰＣＲ仪上防止反应管中反应液蒸发的装置。３．２温度均匀性 狋犲犿狆犲狉犪狋狌狉犲狌狀犻犳狅狉犿犻狋狔温控装置（如加热模块中）内温度的均匀性。３．３生物化学性能试验 犫犻狅犮犺犲犿犻犮犪犾狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲狋犲狊狋通过生物化学方法（如温度敏感ＰＣＲ反应）测定ＰＣＲ仪性能的试验程序。３．４物理性能试验 狆犺狔狊犻犮犪犾狆犲狉犳狅狉犿犪狀犮犲狋犲狊狋通过物理方法测定ＰＣＲ仪性能的试验程序。３．５非精确犘犆犚体系 狀狅狀狉狅犫狌狊狋犘犆犚狊狔狊狋犲犿因偏离预定的ＰＣＲ化学或温度控制程序而导致扩增效果减弱的ＰＣＲ体系。３．６临界位置 犮狉犻狋犻犮犪犾狆狅狊犻狋犻狅狀ＰＣＲ仪多孔反应板中样品的实际温度与显示温度易发生偏离的位置或区域。４ 犘犆犚仪的安装按照生产商说明书中的要求进行安装应在适宜的温度（５℃～４０℃）和湿度（相对湿度≤８０％）环境１犛犖／犜２１０２．２—２００８／犐犛犗／犜犛２０８３６：２００５中安装和运行ＰＣＲ仪。并应将ＰＣＲ仪放置在符合以下条件的位置：———便于检查；———便于ＰＣＲ仪与环境之间稳定的热交换和空气流通；———稳定的环境。５ 犘犆犚仪的维护实验室应根据每台ＰＣＲ仪的使用时间和运行次数建立和实施特定的维护程序。６ 性能试验６．１ 概述利用间接的生化方法或直接的物理方法对ＰＣＲ仪的性能进行试验并记录。６．２ 生化试验法应使用对温度敏感的ＰＣＲ反应对ＰＣＲ仪进行生化性能试验。附录Ａ为生化试验的实例，其他满足要求的ＰＣＲ方法均可使用。应根据仪器的使用时间和运行次数确定每台ＰＣＲ仪的试验频率。６．３ 物理试验法物理试验法是测量ＰＣＲ仪每个样品反应孔在热循环过程中的实际温度并与显示温度进行对比的方法。附录Ｂ为物理试验的实例。当ＰＣＲ仪无法进行生化试验或生化试验显示无扩增效果时，应进行物理试验，并根据使用时间和运行次数确定每台ＰＣＲ仪的试验频率。７ 试验报告和非正常情况的记录实验室应建立文件控制程序，用来确认和描述ＰＣＲ仪的异常情况（详见ＧＢ／Ｔ１５４８１）。试验报告应符合ＧＢ／Ｔ２７０２５的要求，且至少应包括以下内容：———被试验ＰＣＲ仪的编号；———用于试验的方法；———试验日期；———试验分析负责人；———试验结果；———试验过程中观察到的具体细节；———所有与试验标准偏离的情况；———其他与试验有关的信息。８ 安全要求本部分未列出使用中涉及到的所有安全问题。操作者在使用本部分时可能受到由有害物质、仪器设备和操作不当所造成的危害，实验室管理者应预先建立适宜的安全健康规定，以避免危害的发生。２犛犖／犜２１０２．２—２００８／犐犛犗／犜犛２０８３６：２００５附 录 犃（资料性附录）生化性能试验———测量温度准确度的犘犆犚方法犃．１ 概述该方法用于试验ＰＣＲ仪对退火温度控制的准确度，所用试验方法对预设温度与实际退火温度的差异十分敏感。犃．２ 原理犃．２．１ 利用预先设计的ＰＣＲ反应对ＰＣＲ仪预设／显示温度的准确度进行试验。ＰＣＲ样品对ＰＣＲ反应过程中退火温度的升高十分敏感。犃．２．２ 使用标准的Ｍ１３测序引物对ｐＧＥＭ载体克隆位点的旁侧区域进行扩增，得到３６２ｂｐ含ＰＣＲ目标位点的ＤＮＡ序列。其克隆序列见图Ａ．１。ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ ＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴ ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡ ＡＧＣＴＡＴＴＴＡＧ ＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴ ＡＧＡＡＴＡＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＴ ＣＣＡＡＣＧＣＧＴＴ ＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣ ＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣ ＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧ ＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＧＴＧＡＴＴＡＧＣ ＡＡＣＣＴＣＧＧＴＡ ＣＣＡＴＡＴＡＣＴＡ ＡＣＴＣＧＡＴＡＣＡ ＧＡＡＡＣＡＴＣＧＧ ＴＴＧＧＴＧＡＴＣＧＡＴＣＧＡＧＧＴＴＴ ＴＴＡＡＡＡＡＣＣＣ ＣＣＴＣＴＡＧＣＴＡ ＧＣＴＡＧＣＴＡＧＣ ＧＡＴＴＧＣＴＴＣＡ ＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＧＣ ＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴ ＣＡＡＧＴＴＡＣＡＣ ＡＡＴＣＣＣＧＣＧＧ ＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣ ＣＧＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＣＧＴＣＧＧＧ ＣＣＣＡＡＴＴＣＧＣ ＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡ ＧＴＣＧＴＡＴＴＡＣ ＡＡＴＴＣＡＣＴＧＧ ＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴ ＡＣ图犃．１ 用于犘犆犚试验的模板和引物序列犃．２．３ 上述序列为使用Ｍ１３引物（图中双线部分）扩增改进的ｐＧＥＭ质粒（即ｐＳＣ１７）中的目标序列所得到的。图中阴影部分为验证试验的引物（分别命名为ＶＡＬ１和ＶＡＬ２，见Ａ．３．５．３和Ａ．３．５．４），单划线部分为扩增的ＰＣＲ产物，“Ｔ”（方框圈示）为一个错配碱基。注：可使用任何与ｐＧＥＭ质粒等效的质粒（或ＤＮＡ序列）进行试验。犃．２．４ 用琼脂糖凝胶方法能够检测到表明引物ＶＡＬ１和ＶＡＬ２扩增得到的１１６ｂｐ的ＰＣＲ产物。由于引物ＶＡＬ１３’端的错配（Ｔ与Ｃ），使ＰＣＲ反应对高于预设温度的实际退火温度十分敏感。当退火温度从６３℃升高到６６℃时即导致ＰＣＲ扩增失效，无法检测到１１６ｂｐ的扩增片段。反应管应放置在包括临界位置在内的有代表性的温度控制区。对于未确定临界位置的ＰＣＲ仪，应将样品管随机放置在反应板中心和边缘的不同位置。图Ａ．２为９６孔板样品反应管放置实例。１２３４５６７８９１０１１１２ＡａａＢｂｂＣｃｃＤａｂｃＮＥＦａａＧｂｂＨｃｃ 注：标有ａ、ｂ和ｃ的位置代表加有５０００、５００和５０拷贝模板的ＰＣＲ管放置处；Ｎ代表无模板的阴性对照。图犃．２ 犘犆犚反应管在９６孔犘犆犚仪上的分布图３犛犖／犜２１０２．２—２００８／犐犛犗／犜犛２０８３６：２００５犃．３ 试剂应使用适合分子生物学检测的分析纯试剂。犃．３．１ 水：应使用不含ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶的水，也可购买适宜的商业超纯水。犃．３．２ ＰＣＲ反应缓冲液（不含ＭｇＣｌ２）：１０×（１５０ｍｍｏｌ／ＬＴＲＩＳ，ｐＨ８；５００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾）。犃．３．３ 氯化镁溶液（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）。犃．３．４ ｄＮＴＰ溶液［１０ｍｍｏｌ／Ｌ（四种ｄＮＴＰｓ浓度均为１０ｍｍｏｌ／Ｌ）］。犃．３．５ 寡聚核苷酸片段：合成的引物需纯化后方可使用。犃．３．５．１ 扩增３６２ｂｐ目标序列的正向引物：Ｍ１３ｍｐ８噬菌体克隆载体（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：Ｍ７７８２６．１）。引物Ｍ１３（－２６）：５’ＣＡｇｇＡＡＡＣＡｇＣＴＡＴｇＡＣ３’。犃．３．５．２ 扩增３６２ｂｐ目标序列的反向引物：Ｍ１３ｍｐ８噬菌体克降载体（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：Ｍ７７８２６．１）。引物Ｍ１３（－２０）：５’ｇＴＡＡＡＡＣｇＡＣｇｇＣＣＡｇＴ３’。犃．３．５．３ 试验ＰＣＲ仪退火温度的正向引物：引物组成有ＶＡＬ１：５’ｇＡＴＡＣＡｇＡＡＡＣＡＴＣｇｇＴＴｇｇＣ３’。犃．３．５．４ 试验ＰＣＲ仪退火温度的反向引物：引物组成有ＶＡＬ２：５’ｇＴｇＴＡＡＣＴＴｇＡＴｇＣＣＡＴＣＡｇｇ３’。犃．３．６ 质粒ｐＳＣ１７。犃．３．７ 热稳定ＤＮＡ聚合酶：用于热启动ＰＣＲ反应，５Ｕ／μＬ。犃．３．８ 琼脂糖：用于ＤＮＡ电泳，确定ＤＮＡ分离片段的大小。犃．３．９ 硼酸（Ｈ３ＢＯ３）：仅用于配制ＴＢＥ电泳缓冲液。犃．３．１０ 溴酚蓝（Ｃ１９Ｈ９Ｂｒ４Ｏ５ＳＮａ）和（或）二甲苯腈蓝ＦＦ（Ｃ２５Ｈ２７Ｎ２Ｏ６Ｓ２Ｎａ）犃．３．１１ 冰乙酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）：仅用于配制ＴＡＥ电泳缓冲液。犃．３．１２ 乙二胺四乙酸二钠盐（Ｎａ２ＥＤＴＡ，分子式：Ｃ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ８Ｎａ２）。犃．３．１３ 溴化乙啶（ＥｔＢｒ或Ｃ２１Ｈ２０Ｎ３Ｂｒ）。犃．３．１４