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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０８０—２００８栎树猝死病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿犠犲狉狉犲狊，犇犲犆狅犮犽牔犕犪狀犻狀’狋犞犲犾犱２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ和附录Ｄ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准起草人：吴品珊、严进、廖太林、巫燕。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０８０—２００８栎树猝死病菌检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了植物检疫中栎树猝死病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于针对栎树猝死病菌寄主的苗木、原木、树皮、枝条、枝叶等植物部分及其土壤和介质，以及木材、木包装和木制品的入境检疫。２ 原理２．１ 分类地位英文名：ｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｓｕｄｄｅｎｏａｋｄｅａｔｈ，ｐａｔｈｏｇｅｎｏｆｒａｍｏｒｕｍｌｅａｆｂｌｉｇｈｔ学名：犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿Ｗｅｒｒｅｓ，ＤｅＣｏｃｋ＆Ｍａｎｉｎ’ｔＶｅｌｄ栎树猝死病菌（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿），也称多枝疫霉，属真菌界（Ｆｕｎｇｉ），卵菌门（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）卵菌纲（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ），腐霉目（Ｐｙｔｈｉａｌｅｓ），腐霉科（Ｐｙｔｈｉａｃｅａｅ），疫霉属（犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪ｄｅＢａｒｙ）。犘犺狔狋狅狆犺狋犺狅狉犪狉犪犿狅狉狌犿可侵染多种林木和花卉植物，造成栎树等树木猝死（ＳｕｄｄｅｎＯａｋＤｅａｔｈ，简称ＳＯＤ），以及杜鹃、荚!等花卉枝叶枯萎（ＴｗｉｇＢｌｉｇｈｔｏｆＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）。病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录Ａ和附录Ｂ。２．２ 鉴定原理根据栎树猝死病菌在寄主上的为害症状、形态学特性、巢式ＰＣＲ特异性扩增片段作为鉴定依据。３ 仪器和用具３．１ 仪器３．１．１ 生物显微镜，体视显微镜。３．１．２ 光照生物培养箱。３．１．３ 高压灭菌器。３．１．４ 高速离心机。３．１．５ ＰＣＲ扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。３．２ 用具３．２．１ 塑料盒。３．２．２ 黑光灯（１８Ｗ，３２０ｎｍ～３８０ｎｍ）。３．２．３ 塑料研杵，移液器。４ 试剂和培养基４．１ 试剂４．１．１ 琼脂粉，Ｖ８液，胡萝卜，杜鹃叶片。４．１．２ ５０％匹马霉素，氨苄青霉素钠盐，利福平钠盐，五氯硝基苯，碳酸钙。４．１．３ ＳＤＳ，ＴｒｉｓＨＣｌ，氯化镁，盐酸，ＥＤＴＡ，氢氧化钠，乙酸钠，氯化钾，Ｔｒｉｓ，ＣＴＡＢ，ＴＢＥ，无水乙醇，苯酚，溴化乙锭（ＥＢ），三氯甲烷，异丙醇，异戊醇。４．１．４ 蛋白酶Ｋ，犜犪狇聚合酶，ｄＮＴＰ，ＤＮＡ分子量Ｍａｒｋｅｒ（１００ｂｐ）。４．１．５ 巢式ＰＣＲ引物Ｐｈｙｔｏ１／Ｐｈｙｔｏ４、Ｐｈｙｔｏ２／Ｐｈｙｔｏ３。１犛犖／犜２０８０—２００８４．２ 培养基４．２．１ 选择性培养基犘犃犚犘犞８５０ｍＬ过滤后的Ｖ８液，１７ｇ琼脂，９５０ｍＬ蒸馏水，灭菌后冷却到５０℃，加入在５０％的匹马霉素０．０１ｇ、氨苄青霉素钠盐０．２５ｇ、利福平钠盐０．０１ｇ和五氯硝基苯０．０５ｇ（可按比例在二甲基亚砜中溶解后加入）。４．２．２ 胡萝卜丝培养基犆犘犃５０ｇ胡萝卜切丝，２２ｇ琼脂，１０００ｍＬ蒸馏水，灭菌。４．２．３ 犞８培养基Ｖ８液体１００ｍＬ，加入２．５ｇ碳酸钙，１５ｇ琼脂，蒸馏水９００ｍＬ，灭菌。５ 鉴定方法５．１ 症状检查检验苗木时，主要查验枝梢和叶部。杜鹃花等花卉植物症状为叶片上有黑褐色病斑，茎部有凹陷溃疡斑，枝梢和叶常出现枯萎。检验栎树等原木木材时，重点查验溃疡斑。溃疡凹陷或平坦，常有暗红至黑色的粘性流胶渗出，树皮内部组织褪色，坏死区域的边缘有黑环围绕。取有疑似症状的植物的叶、枝、树皮、根等植物部分做分离培养。土壤和栽培介质也是传播病菌的主要途径，检验时收集被携带进境的土壤和栽培介质，做诱集试验。５．２ 分离培养和诱集５．２．１ 植物组织和木材的分离培养取植物组织或木材上的病健交界处（无明显症状的取靠近地下部的组织）５ｍｍ～１０ｍｍ，０．５％次氯酸钠消毒２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，在选择性培养基ＰＡＲＰＶ８和胡萝卜丝培养基ＣＰＡ上，２０℃～２２℃黑暗培养１周～２周。如有白色真菌菌落出现，可转入Ｖ８培养基上２０℃１２ｈ光照／１２ｈ黑暗培养。５．２．２ 土壤和栽培介质的诱集塑料盒中放入土壤或介质，加入２倍体积的无菌双蒸水，将数张健康的杜鹃叶片（国内市场上杜鹃品种即可）流水冲洗干净，滤纸吸干水分，叶面朝上漂放在水上，盖上盒盖，１５℃１２ｈ光照／１２ｈ黑暗培养。３ｄ后开始检查，取有失绿或水浸状斑的叶片，切取病健交界处，在胡萝卜丝培养基２０℃～２２℃黑暗培养１周～２周。５．３ 分子生物学鉴定５．３．１ 犇犖犃提取将有疑似症状的植物叶片、枝条、茎，以及分离出的菌丝，按ＣＴＡＢ法提取ＤＮＡ（参见附录Ｃ）。５．３．２ 巢式犘犆犚检测犘．狉犪犿狅狉狌犿首轮ＰＣＲ特异性引物Ｐｈｙｔｏ１和Ｐｈｙｔｏ４序列分别为５′ＣＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＴＴＧＡ３′，５′ＧＡＡＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＣＡＡＧ３′，第２轮引物Ｐｈｙｔｏ２和Ｐｈｙｔｏ３的序列分别为５′ＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣ３′，５′ＧＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧ３′。两轮ＰＣＲ的反应体系和反应条件相同，第２轮ＤＮＡ样品为稀释５００倍的首轮ＰＣＲ产物。２５μＬ的反应体系有样品ＤＮＡ５μＬ，１０ＸＰＣＲｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ，２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁４μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ０．５μＬ，５μｍｏｌ／ＬＰｒｉｍｅｒｓ１．２５μＬ／１．２５μＬ，５Ｕ／μＬ犜犪狇聚合酶０．２５μＬ，双蒸水１０．２５μＬ。反应条件为→９４℃８５ｓ９３℃３５ｓ、６２℃５５ｓ、７２℃５０ｓ，３５→个循环７２℃１０ｍｉｎ。在０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液中，１．５％琼脂糖凝胶电泳，５Ｖ／ｃｍ，０．５％ＥＢ染色２０ｍｉｎ，凝胶成像仪分析结果。必要时做荧光ＰＣＲ检测（参见附录Ｄ）。２犛犖／犜２０８０—２００８５．４ 菌种保藏将分离菌接在Ｖ８培养基上，待菌落长满后，切成边长１ｃｍ小块，放在有无菌水的试管中，封好，室温保存。６ 鉴定标准６．１ 菌落特征和病菌形态犘．狉犪犿狅狉狌犿的生长速度相对较慢，在ＰＡＲＰＶ８和ＣＰＡ上为２ｍｍ／ｄ～３ｍｍ／ｄ。ＰＡＲＰＶ８上的菌落稀薄，菌丝在培养基间生长，珊瑚状，气生菌丝极少；ＣＰＡ上菌落呈同心环，稍稀疏，气生菌丝不多。Ｖ８培养基上生长较好，菌落致密、平铺。犘．狉犪犿狅狉狌犿在生长３ｄ后开始产生大量的厚垣孢子，分生孢子囊在有光照时可大量生成。犘．狉犪犿狅狉狌犿的菌丝多节，高度分枝，弯曲，成树枝状结构，产生孢子囊、厚垣孢子和卵孢子。孢子囊大多为椭圆形、纺锤体形或长卵形，有半乳突，易脱落，无柄或具有短柄，长×宽范围值为（２５μｍ～９７μｍ）×（１４μｍ～３４μｍ），平均２４μｍ×５２μｍ，长宽比范围为１．８～２．４，犘．狉犪犿狅狉狌犿孢子囊较长的特征是它与其他近似种区分的重要特性。厚垣孢子由菌丝端产生，球形，壁薄，在培养基上先为透明，然后发展至浅褐色、褐色，形态很大，直径一般为４６．４μｍ～６０．１μｍ，最大可达８８μｍ，犘．狉犪犿狅狉狌犿的厚垣孢子大、产生丰盛也是它的主要特征之一。病菌为异宗配合，卵孢子大小为２７．２μｍ～３１．４μｍ。６．２ 犘犆犚特异性产物巢式ＰＣＲ的首轮特异性扩增片段为６８７ｂｐ，第２轮特异性扩增片段为２９１ｂｐ。７ 结果判定根据栎树猝死病菌的鉴定标准（见第６章），对分离菌和核酸提取物进行判定。如分离菌的形态特征或ＰＣＲ产物与鉴定指标吻合，可鉴定为栎树猝死病菌，否则，不视为栎树猝死病菌。３犛犖／犜２０８０—２００８附 录 犃（资料性附录）栎树猝死病菌的世界分布 北美洲：美国（加利福尼亚州、俄勒冈州）。欧洲：德国、荷兰、波兰、西班牙、英国、比利时、法国、意大利、丹麦、瑞典、爱尔兰、斯洛文尼亚、芬兰、瑞士、挪威。４犛犖／犜２０８０—２００８附 录 犅（资料性附录）栎树猝死病的主要寄主表犅．１ 栎树猝死病的主要寄主编号学 名英 文 名中 文 名１ 犃犫犻犲狊犮狅狀犮狅犾狅狉 Ｗｈｉｔｅｆｉｒ 白冷杉２ 犃犫犻犲狊犵狉犪狀犱犻狊 Ｇｒａｎｄｆｉｒ 巨冷杉３ 犃犫犻犲狊犿犪犵狀犻犳犻犮犪 Ｒｅｄｆｉｒ 加州红冷杉４ 犃犮犲狉犮犻狉犮犻狀犪狋狌犿 Ｖｉｎｅｍａｐｌｅ 圆叶槭５ 犃犮犲狉犱犪狏犻犱犻犻 Ｓｔｒｉｐｅｄｂａｒｋｍａｐｌｅ 大卫槭６ 犃犮犲狉犾犪犲狏犻犵犪狋狌犿 Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎｍａｐｌｅ 光叶槭７ 犃犮犲狉犿犪犮狉狅狆犺狔犾犾狌犿 Ｂｉｇｌｅａｆｍａｐｌｅ 大叶槭８ 犃犮犲狉狆狊犲狌犱狅狆犾犪狋犪狀狌狊 Ｐｌａｎｅｔｒｅｅｍａｐｌｅ 欧洲槭９ 犃犱犻犪狀狋狌犿犪犾犲狌狋犻犮狌犿 Ｗｅｓｔｅｒｎｍａｉｄｅｎｈａｉｒｆｅｒｎ 铁线蕨１０ 犃犱犻犪狀狋狌犿犼狅狉犱犪狀犻犻 Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｍａｉｄｅｎｈａｉｒｆｅｒｎ 加州铁线蕨１１ 犃犲狊犮狌犾狌狊犮犪犾犻犳狅狉狀犻犮犪 Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｂｕｃｋｅｙｅ 加州七叶树１２ 犃犲狊犮狌犾狌狊犺犻狆狆狅犮犪狊狋犪狀狌犿 Ｈｏｒｓｅｃｈｅｓｔｎｕｔ 欧洲七叶树１３ 犃狉犫狌狋狌狊犿犲狀狕犻犲狊犻犻 Ｍａｄｒｏｎｅ 优材草莓树１４ 犃狉犫狌狋狌狊狌狀犲犱狅 Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙｔｒｅｅ 草莓树１５ 犃狉犮狋狅狊狋犪狆犺狔犾狅狊犮狅犾狌犿犫犻犪狀犪 Ｍａｎｚａｎｉｔａ 毛枝熊果１６ 犃狉犮狋狅狊狋犪狆犺狔犾狅狊犿犪狀狕犪狀犻狋犪 Ｍａｎｚａｎｉｔａ 北加州熊果树１７ 犃狉犮狋狅狊狋犪狆犺狔犾狅狊狌狏犪狌狉狊犻 Ｋｉｎｎｉｋｉｎｎｉｃｋ，Ｂｅａｒｂｅｒｒｙ 熊果１８ 犃狉犱犻狊犻犪犼犪狆狅狀犻犮犪 Ａｒｄｉｓｉａ 紫金牛１９ 犆犪犾犾狌狀犪狏狌犾犵犪狉犻狊 Ｈｅａｔｈ 欧洲石楠２０ 犆犪犾狔犮犪狀狋犺狌狊狅犮犮犻犱犲狀狋犪犾犻狊 Ｓｐｉｃｅｂｕｓｈ 加州蜡梅２１ 犆犪犿犲犾犾犻犪ｓｐｐ． Ｃａｍｅｌｌｉａ 山茶属２２ 犆犪狊狋犪狀犲犪狊犪狋犻狏犪 Ｓｗｅｅｔｃｈｅｓｔｎｕｔ 欧洲栗２３ 犆犪狊狋犪狀狅狆狊犻狊狅狉狋犺犪犮犪狀狋犺犪 Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ 元江栲２４ 犆犲犪狀狅狋犺狌狊狋犺狔狉狊犻犳犾狅狉狌狊 Ｂｌｕｅｂｌｏｓｓｏｍ 青花２５ 犆犻狀狀犪犿狅犿狌犿犮犪犿狆犺狅狉犪 Ｃａｍｐｈｏｒｔｒｅｅ 樟树２６ 犆犾犻狀狋狅狀犻犪犪狀犱狉犲狑狊犻犪狀犪 Ａｎｄｒｅｗ’ｓｃｌｉｎｔｏｎｉａｂｅａｄｌｉｌｙ 安德鲁七筋姑２７ 犆狅狉狀狌狊犽狅狌狊犪×犆狅狉狀狌狊犮犪狆犻狋犪狋犪 ＣｏｒｎｕｓＮｏｒｍａｎｈａｄｄｏｎ 四照花２８ 犆狅狉狔犾狌狊犮狅狉狀狌狋犪 Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｈａｚｅｌｎｕｔ 加州榛子２９ 犇犻狊狋狔犾犻狌犿犿狔狉犻犮狅犻犱犲狊 ＭｙｒｔｌｅｌｅａｆｅｄＤｉｓｔｙｌｉｕｍ 杨梅蚊母树３０ 犇狉犻犿狔狊狑犻狀狋犲狉犻 Ｗｉｎｔｅｒ’ｓｂａｒｋ 卤室木５犛犖／犜２０８０—２００８表犅．１（续）编号学 名英 文 名中 文 名３１ 犇狉狔狅狆狋犲狉犻狊犪狉犵狌狋犪 Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｗｏｏｄｆｅｒｎ 加州木蕨３２ 犈狌犮犪犾狔狆狋狌狊犺犪犲犿犪狊狋狅犿犪 Ｓｃｒｉｂｂｌｙｇｕｍ 红口桉３３ 犈狌狅狀狔犿狌狊犽犻犪狌狋狊犮犺狅狏犻犮狌狊 Ｓｐｒｅａｄｉｎｇｅｕｏｎｙｍｕｓ 胶东卫矛３４ 犉犪犵狌狊狊狔犾狏犪狋犻犮犪 Ｅｕｒｏｐｅａｎｂｅｅｃｈ 紫叶水青冈３５ 犉狉犪狀犵狌犾犪犮犪犾犻犳狅狉狀犻犮犪（＝犚犺犪犿狀狌狊犮犪犾犻犳狅狉狀犻犮犪） Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｃｏｆｆｅｅｂｅｒｒｙ 加州鼠李３６ 犉狉犪狀犵狌犾犪狆狌狉狊犺犻犪狀犪（＝犚犺犪犿狀狌狊犘狌狉狊犺犻犪狀犪） Ｃａｓｃａｒａ 北美鼠李３７ 犉狉犪狓犻狀狌狊犲狓犮犲犾狊犻狅狉 Ｅｕｒｏｐｅａｎａｓｈ 欧洲白蜡树３８ 犉狉犪狓犻狀狌狊犾犪狋犻犳狅犾犻犪 Ｏｒｅｇｏｎａｓｈ 阔叶白蜡树３９ 犌犪狉狉狔犪犲犾犾犻狆狋犻犮犪 Ｓｉｌｋｔａｓｓｅｌｔｒｅｅ，Ｃｏａｓｔｓｉｌｋｔａ