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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１７７７．３—２００８动物源食品中大环内酯类抗生素残留检测方法 第３部分：微生物抑制法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犪犮狉狅犾犻犱犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狅犱—犘犪狉狋３：犕犻犮狉狅犫犻犪犾犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱２００８０９１６发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本部分的附录Ａ为规范性附录，附录Ｂ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本部分主要起草人：王敏、顾鸣、郭德华、杨捷琳、韩丽、邓晓军、杨惠琴、陈墨莲。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１７７７．３—２００８动物源食品中大环内酯类抗生素残留检测方法 第３部分：微生物抑制法１ 范围ＳＮ／Ｔ１７７７的本部分规定了动物源食品中大环内酯类兽药残留检测的试样制备、保存和微生物抑制检测方法。本部分适用于肉类、水产品、动物内脏、鸡蛋和牛奶中大环内酯类兽药筛选检测，阳性结果应用其他方法进行确证。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ１７７７的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）３ 试样制备和保存３．１ 试样制备３．１．１ 牛奶：取不少于５００ｍＬ试样，装入清洁容器内，进行标记。３．１．２ 肉类、水产品、动物内脏：从原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入高速组织捣碎机均质，充分混匀，用四分法缩分不少于５００ｇ试样。装入清洁容器内，进行标记。３．１．３ 蛋：从原始样品中，随机分出一半（不少于５００ｇ），鲜蛋需去壳，进行标记。注：制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。３．２ 试样保存３．２．１ 牛奶：０℃～４℃保存。３．２．２ 肉类、水产品、动物内脏和蛋：试样于－１８℃以下保存。４ 测定方法４．１ 方法提要试样经压榨得到样液，样液加到含有一定数量的嗜热脂肪芽孢杆菌培养基中，６４℃培养３ｈ～４ｈ。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。４．２ 设备和材料４．２．１ 恒温箱：６４℃±１℃。４．２．２ 离心机。４．２．３ 高速组织捣碎机。４．２．４ 均质器。４．２．５ 恒温水浴锅：８０℃。４．２．６ 涡旋振荡器。４．２．７ 肉类榨汁器。１犛犖／犜１７７７．３—２００８４．２．８ 克氏瓶。４．２．９ 安瓿。４．２．１０ 可调移液器：１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ。４．３ 菌种和培养基４．３．１ 菌种４．３．１．１ 嗜热脂肪芽孢杆菌 犅犪犮犻犾犾狌狊狊狋犲犪狉狅狋犺犲狉犿狅狆犺犻犾狌狊ｖａｒ．犮犪犾犻犱狅犾犪犮狋犻狊ＡＴＣＣ１０１４９。４．３．２ 培养基４．３．２．１ 细菌保存及传代培养基：见附录Ａ第Ａ．１章。４．３．２．２ 增菌固体培养基：见附录Ａ第Ａ．２章。４．３．２．３ 检定培养基：见附录Ａ第Ａ．３章。４．４ 试剂本标准所用化学试剂为分析纯，试验用水为蒸馏水、去离子水，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２的规定。４．４．１ 指示剂：溴甲酚紫，制法见附录Ａ．３．２。４．４．２ 甲醇。４．４．３ 标准溶液：４．４．３．１ 标准物质泰乐菌素：纯度≥９８％。４．４．３．２ 泰乐菌素标准储备液：１００μｇ／ｍＬ。称取标准物质泰乐菌素１０．０ｍｇ（精确至０．１ｍｇ），用甲醇溶解并定容至１００ｍＬ，得到终浓度为１００μｇ／ｍＬ的泰乐菌素标准储备液，置２℃～８℃冰箱中保存，可使用１个月。４．４．３．３ 泰乐菌素标准工作液：０．０５μｇ／ｍＬ。吸取一定量的泰乐菌素标准储备液，用甲醇稀释成０．０５μｇ／ｍＬ的泰乐菌素标准工作液，置２℃～８℃冰箱中保存，可使用１周。４．５ 测定步骤４．５．１ 样液制备４．５．１．１ 肉类、水产品、动物内脏：用肉类榨汁器榨汁，取大约２５０μＬ汁液作为待测样液。４．５．１．２ 蛋：取禽蛋液体至清洁容器中，均质后直接取样。４．５．１．３ 牛奶：直接取样。４．５．２ 菌悬液的制备一般情况下，菌种的传代次数不应超过５代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌固体培养基的克氏瓶中，５５℃±１℃培养７２ｈ镜检芽孢数达８０％以上（如果达不到，可再培养数日，芽孢数量仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用），用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，８０℃水浴加热３０ｍｉｎ，２０００犵离心２０ｍｉｎ，弃上清液，用灭菌生理盐水重复洗涤芽孢两次。然后用灭菌生理盐水制成菌悬液，用稀释平板计数的方法或比浊法进行菌体计数以确定菌悬液的浓度，菌悬液中菌体细胞的含量应达到１．０×１０８ＣＦＵ／ｍＬ。置２℃～８℃冰箱保存，贮存期１个月。４．５．３ 检定安瓿的制备将嗜热脂肪芽孢杆菌菌悬液加入到融化后冷却至６０℃左右的灭菌检定培养基中，充分混匀，使培养基中嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。在灭菌安瓿中加入１ｍＬ混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定安瓿，加入１００μＬ０．０５μｇ／ｍＬ泰乐菌素标准工作液，室温放置２０ｍｉｎ后，６４℃±１℃培养３ｈ～４ｈ，琼脂培养基颜色不变色，仍呈现紫色的安瓿为合格，达不到要求的安瓿应弃去。制备好的安瓿置２℃～８℃冰箱可保存１周。４．５．４ 测定取制备好的检定安瓿，其中一个加入１００μＬ０．０５μｇ／ｍＬ泰乐菌素标准工作液作为阳性对照，一２犛犖／犜１７７７．３—２００８个加入１００μＬ阴性样品样液作为阴性对照。吸取１００μＬ待测样液加入检定安瓿中，将安瓿放置室温，２０ｍｉｎ预扩散；对于蛋、鱼、肾脏样品，预扩散后，需置于８０℃水浴加热１０ｍｉｎ。预扩散后，用蒸馏水洗涤安瓿两次，洗去待测样液，去除安瓿内剩余的水，用铝箔纸封住安瓿口。将安瓿置于培养箱中，６４℃±１℃培养３ｈ～４ｈ，直到阴性对照安瓿颜色变为黄色时停止培养。取出安瓿，根据安瓿内固体琼脂底部的三分之二部分的颜色判定结果。４．６ 检测结果判断和报告如果待测样液安瓿内琼脂底部三分之二部分由紫色变为黄色，阳性对照安瓿内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“阴性”。如果待测样液安瓿和阳性对照安瓿内琼脂底部三分之二部分仍呈现紫色，即报告“初筛阳性”。初筛阳性的样品可进一步用β内酰胺酶排除β内酰胺类药物，Ｐ氨基苯酸排除磺胺类药物的可能（参见附录Ｂ第Ｂ．２章）。阳性样品需要用确证方法进行定性和定量分析。５ 检测限检测限见表１。表１ 检测限大环内酯类兽药检测限／（μｇ／ｋｇ）泰乐菌素５０红霉素５０柱晶白霉素５０交沙霉素５０螺旋霉素５０替米考星５０３犛犖／犜１７７７．３—２００８附 录 犃（规范性附录）培 养 基犃．１ 细菌保存培养基犃．１．１ 成分胰蛋白胨 １５．０ｇ植物蛋白胨５．０ｇ氯化钠５．０ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．３±０．２犃．１．２ 制法将各成分加热溶解，分装试管，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ，制成斜面。注：制成半固体时，琼脂量为０．５％。犃．２ 增菌固体培养基犃．２．１ 成分胰蛋白胨 １７．０ｇ植物蛋白胨３．０ｇ氯化钠５．０ｇ磷酸氢二钾２．５ｇ蒸馏水１０００ｍＬ琼脂２０ｇｐＨ７．３±０．２犃．２．２ 制法将各成分加热溶解，分装３００ｍＬ于克氏瓶内，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。犃．３ 检定培养基犃．３．１ 成分牛肉膏 ３．０ｇ大豆蛋白胨０．３ｇ蛋白胨５．０ｇ琼脂１５．０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ氯化钠０．５ｇ磷酸氢二钾０．２５ｇ吐温８０１．０ｇ溴甲酚紫０．０６ｇ葡萄糖５．２５ｇｐＨ７．８±０．２４犛犖／犜１７７７．３—２００８犃．３．２ 制法０．６％溴甲酚紫溶液配制：称取０．６ｇ溴甲酚紫溶于１００ｍＬ蒸馏水中。将各成分加热溶解，分装每瓶１００ｍＬ，每瓶中加入０．６％溴甲酚紫溶液１ｍＬ，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ。５犛犖／犜１７７７．３—２００８附 录 犅（资料性附录）菌种的理化性状测定和β内酰胺类、磺胺类药物的排除犅．１ 菌种的理化性状测定定期对菌种进行理化性状测试，以确定菌种没有受到污染或变异。对性状改变的菌种，需购置新的ＡＴＣＣ菌种。测试的基本方法如下：将菌种ＡＴＣＣ１０１４９接种到传代培养基上，６４℃培养１８ｈ后菌落为黄色，鉴定结果见表Ｂ．１。表犅．１ 菌种犃犜犆犆１０１４９生化反应菌种项 目结 果革兰氏染色镜检Ｇ＋酪素水解７５％～８４％＋淀粉水解＋精氨酸氨甲酰天冬氨酸脱水酶水解—吲哚水解—明胶水解＋卡巴肼水解—树胶醛醣—甘油水解７５％～８４％＋肝糖水解＋菊粉—甘露醇水解—水杨苷水解１６％～２５％＋犇海藻糖水解＋卵磷脂— 注：“＋”表示阳性；“—”表示阴性。犅．２ β内酰胺类和磺胺类药物的排除对于初筛阳性的样品，加入２０μＬβ内酰胺酶溶液（１１０活性单位／ｍＬ）到２３０μＬ样液中，混匀后，吸取１００μＬ到检定安瓿中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有β内酰胺类药物。对于初筛阳性的样品，加入５０μＬ狆氨基苯酸溶液（５ｍｇ／ｍＬ）到２００μＬ样液中，混匀后，吸取１００μＬ到检定安瓿中培养。如果测定结果为阴性，则样品中可能含有磺胺类药物。６犛犖／犜１７７７．３—２００８犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃狅犳狋犺犻狊狆犪狉狋犻狊犪狀狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓．犃狀狀犲狓犅狅犳狋犺犻狊狆犪狉狋犻狊犪狀犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓．犜犺犻狊狆犪狉狋狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲犱狅犳犮犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犪犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀犪犱犿犻狀犻狊狋犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狆犪狉狋狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犛犺犪狀犵犺犪犻犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犕犪犻狀犇狉犪犳狋犲狉狅犳狋犺犻狊狆犪狉狋犪狉犲犠犪狀犵犕犻狀，犌狌犕犻狀犵，犌狌狅犇犲犺狌犪，犢犪狀犵犑犻犲犾犻狀，犎犪狀犔犻，犇犲狀犵犡犻犪狅犼狌狀，犢犪狀犵犎狌犻狇犻狀，犆犺犲狀犕狅犾犻犪狀．犜犺犻狊狆犪狉狋犻狊犪狆狉狅犳犲狊狊犻狅狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱犳狅狉犲狀狋狉狔犲狓犻狋犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅犿狌犾犵犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犳犻狉狊狋狋犻犿犲．７犛犖／犜１７７７．３—２００８犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犪犮狉狅犾犻犱犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狅犱—犘犪狉狋３：犕犻犮狉狅犫犻犪犾犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱１ 犛犮狅狆犲犛犖／犜１７７７狋犺犻狊狆犪狉狋狊狆犲犮犻犳犻犲狊狋犺犲犿犲狋犺狅犱狅犳狊犪犿狆犾犲狆狉犲狆犪狉犪狋犻狅狀犪狀犱犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犪犮狉狅犾犻犱犲狉犲狊犻犱狌犲狊犫狔犿犻犮狉狅犫犻犪犾犻狀犺犻犫犻狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犻狀犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狅犱．犜犺犻狊狆犪狉狋犻狊犪狆狆犾犻犮犪犫犾犲狋狅狋犺犲狊犮狉犲犲狀犻狀犵犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀狅犳犿犪犮狉狅犾犻犱犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋，犳犻狊犺犲狉狔狆狉狅犱狌犮狋，犪狀犻犿犪犾犺犪狉狊犾犲狋，犿犻犾犽犪狀犱犲犵犵．犃狀狔狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲狊狌犾狋狊犺狅狌犾犱犫犲犮狅狀犳犻狉犿犲犱犫狔狅狋犺犲狉犿犲狋犺狅犱．２ 犖狅狉犿犪狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲犜犺犲犳狅犾犾狅狑犻狀犵狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犮狅狀狋犪犻狀狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狑犺犻犮犺，狋犺狉狅狌犵犺狉犲犳犲狉犲狀犮犲犻狀狋犺犻狊狋犲狓狋，犮狅狀狊狋犻狋狌狋