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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１５８６．２—２００８菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻狆狏．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪（犅狌狉犽犺狅犾犱犲狉）犌犪狉犱犪狀犲狋犪犾．２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本部分的附录Ｂ和附录Ｃ为规范性附录，附录Ａ为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人：刘鹏、崔铁军、廖芳、刘跃庭、冯洁、王金成。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１５８６．２—２００８菜豆晕疫病菌检疫鉴定方法１ 范围ＳＮ／Ｔ１５８６的本部分规定了进出境植物检疫中菜豆晕疫病菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻ｐｖ．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪）的检疫鉴定方法。本部分适用于进出境菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）等的植物种子中菜豆晕疫病菌的检疫和鉴定。２ 原理２．１ 病菌分类地位和重要特征菜豆晕疫病（Ｈａｌｏｂｌｉｇｈｔｏｆｂｅａｎｓ）是菜豆、大豆等豆科植物上的严重病害，该病的病原菌为菜豆晕疫病菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻ｐｖ．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪）。菜豆晕疫病菌属原核生物界（Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｅｓ），薄壁菌门（Ｇｒａｃｉｌｉｃｕｔｅｓ），假单胞菌科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｃｅａｅ），假单胞菌属（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊）；单胞，杆状，直或微弯，革兰氏阴性，极鞭单生或多生，能运动，无鞘，无孢子，一般大小（０．５μｍ～１．０μｍ）×（０．４μｍ～１．５μｍ），代谢呼吸型，化能有机营养型，接触酶阳性，精氨酸双水解酶阴性，氧化酶阴性。相关资料参见附录Ａ。２．２ 鉴定原理菜豆晕疫病菌的形态特征、生物学特性、生化特性、寄主范围、传播途径，以及分子生物学特征作为制定本检疫鉴定标准的依据。３ 仪器、用具———生物显微镜；———生物安全柜（或超净工作台）；———高压灭菌器；———小型电动粉碎机；———恒温培养箱；———离心机；———ＰＣＲ仪；———电泳设备；———凝胶成像系统；———其他常规实验室设备、器具及试剂。４ 主要试剂除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水。ＰＣＲ反应体系用水双蒸水。其他试剂比如各种溶液、缓冲液和培养基都是检测方法特有的，都应按附录要求准备。商品化试剂参见其使用说明。双氧水（３％），蛋白胨，酵母粉，硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ），蔗糖（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１），磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４），琼脂，多聚蛋白胨，甘油，乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），盐酸，冰乙酸，磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４），磷酸氢二钠（ＮａＨ２ＰＯ４），琼脂糖，溴化乙锭，犜犪狇ＤＮＡ聚合酶，１０×ＰＣＲ缓冲液，ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌｅａｃｈ），溴酚蓝，二甲苯青ＦＦ，２０００ｂｐＭａｒｋｅｒ。１犛犖／犜１５８６．２—２００８细菌微量生化鉴定管：Ｄ甘露醇，戊二酸盐。生化鉴定试纸条：氧化酶试纸条。５ 检疫鉴定方法及步骤５．１ 病原菌的分离５．１．１ 植株分离方法５．１．１．１ 种植观察将待测的种子种植于温室或实验室的育苗钵中，每一育苗钵种植２粒种子，每份种子样品种植不少于３０００粒，生长环境适宜温度为２０℃～２５℃，相对湿度大于或等于７０％，种子出苗１周后开始观察。发生病害的典型症状为种植期间有发病的幼苗，叶片表现为褪色花叶型，有萎蔫的情况。若观察到有典型症状的发生，则采集可疑病株进行病原菌的分离培养。５．１．１．２ 病叶中病原菌的分离用灭菌剪刀剪取病叶上的病斑，用含有效氯１％的次氯酸钠溶液表面消毒１ｍｉｎ，无菌水清洗三次，然后将其移至灭菌培养皿上，加５滴～６滴无菌水，用灭菌镊子将病斑夹碎，使病组织液溶于无菌水中。用接种环蘸取该液，在选择性培养基（ＭＳＰ，见附录Ｂ）上划线，每一处理做三个平皿（规格直径为９０ｍｍ，下同），２８℃恒温培养４８ｈ。５．１．２ 种子分离方法选取待测菜豆种子１５０ｇ，用７５％酒精浸泡１ｍｉｎ，无菌水清洗三次，在无菌环境中晾干；将种子放入经灭菌处理的小型电动粉碎机中破碎（或将晾干的种子放入灭菌纸袋中，用锤子砸碎），之后装入一灭菌的大三角瓶中，加灭菌水２００ｍＬ，４℃振荡过夜；取浸出液进行差速离心，１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃沉淀，取上清液再进行８０００ｒ／ｍｉｎ的离心１０ｍｉｎ，之后将沉淀用２ｍＬ无菌水稀释；取稀释液１ｍＬ再进行系列浓度的稀释，分别为１／１０，１／１００，１／１０００，１／１００００，１／１０００００：将每个浓度的稀释液在ＭＳＰ培养基平皿上进行涂布，１０μＬ／平皿，每个浓度做三个平皿。培养皿在２８℃恒温条件下培养４８ｈ。５．２ 可疑菌株的分离纯化根据附录Ｂ中菌落在ＭＳＰ培养基上的菌落特征，挑取可疑的单个菌落，在５２３或金氏Ｂ培养基上连续转接２次～３次，可得到纯化后的分离菌。对可疑菌株进行下一步骤。５．３ 革兰氏染色对可疑菌株进行革兰氏染色。用牙签挑取菌落放在载玻片上与３％氢氧化钾（ＫＯＨ）液滴搅拌，然后慢慢拉出，有拉丝现象的为革兰氏阴性菌，无拉丝现象的一般为革兰氏阳性菌。对可疑菌株进行革兰氏染色。可用革兰氏染色试剂进行简单染色观察菌体形状。若可疑菌株经鉴定为革兰氏阴性菌，且菌体形状为杆状，则进行下一步骤（见５．４）。否则排除可疑菌落。５．４ 生化指标初筛检测对可疑菌株进行以下四项生化指标的检测。对于能够符合生化指标（接触酶阳性，氧化酶阴性，Ｄ甘露醇阴性，戊二酸盐阴性）的菌株，则进行下一步骤（见５．５）。否则排除可疑菌落。５．５ 分子生物学检测采用特异性引物Ｐ１／Ｐ２对可疑菌株进行ＰＣＲ检测，用菜豆晕疫病菌标准菌株作阳性对照，用非菜豆晕疫病菌的植物病原细菌作阴性对照，用水作空白对照，进行ＰＣＲ扩增，扩增产物进行电泳分析。在阳性对照扩增片段大小为０．５ｋｂ的单带的前提下，可疑菌株扩增结果与阳性对照一致，可判断分子生物学检测结果为阳性。具体实验步骤和试剂配置见附录Ｃ。６ 结果判定若分离的细菌菌株在选择性培养基上的菌落特征与描述相符、符合革兰氏染色阴性的结果和菌体２犛犖／犜１５８６．２—２００８形状为杆状、符合５．４中各项生化指标的检测结果、分子生物学检测为阳性，可以判定检出菜豆晕疫病菌。７ 菌株保存分离并最终鉴定为菜豆晕疫病菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于４℃左右低温冰箱中保存，定期（３０ｄ～６０ｄ）转接，以防止病菌死亡；必要时冻干后长期保存。３犛犖／犜１５８６．２—２００８附 录 犃（资料性附录）菜豆晕疫病菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻狆狏．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪）相关资料犃．１ 英文名Ｈａｌｏｂｌｉｇｈｔｏｆｂｅａｎｓ。犃．２ 学名犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻ｐｖ．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪。犃．３ 分布埃塞俄比亚，肯尼亚，马达加斯加，马拉维，毛里求斯，摩洛哥，罗德里格斯岛，卢旺达，南非，坦桑尼亚，乌干达，刚果，赞比亚，津巴布韦，印度，以色列，日本，巴基斯坦，沙特阿拉伯，土耳其，也门，澳大利亚，斐济，新西兰，奥地利，比利时，英国，保加利亚，捷克，斯洛伐克，丹麦，法国，德国，匈牙利，爱尔兰，意大利，荷兰，波兰，罗马尼亚，西班牙，瑞典，瑞士，前苏联，前南斯拉夫，加拿大，墨西哥，美国，巴巴多斯，哥斯达黎加，多米尼加共和国，瓜德罗普群岛，马提民克，圣文森特，阿根廷，智利，哥伦比亚，秘鲁，苏里南，委内瑞拉，中国（黑龙江）。犃．４ 寄主范围菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）、大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓）、豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿）、绿豆（犞犻犵狀犪狉犪犱犻犪狋犪）、木豆（犆犪犼犪狀狌狊犮犪犼犪狀）、多花菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊犮狅犮犮犻狀犲狌狊）、月豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊犾狌狀犪狋狌狊）、葛（犘狌犲狉犪狉犻犪犾狅犫犪狋犪）、野葛（犘狌犲狉犪狉犻犪狋犺狌狀犫犲狉犵犻犪狀犪）、戆豆（犞犻犵狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪）、桑橙（犕犪犮狉狅狆狋犻犾犻狌犿犪狋狉狅狆狌狉狆狌狉犲狌犿）、犌犾狔犮犻狀犲犼犪狏犪狀犻犮犪、犌犾狔犮犻狀犲狑犻犵犺狋犻犻。犃．５ 传播方式菜豆晕疫病菌主要通过带菌种子作远距离传播。在田间则通过风雨、灌溉传播。４犛犖／犜１５８６．２—２００８附 录 犅（规范性附录）菜豆晕疫病菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻狆狏．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪）常用的培养基配方犅．１ 金氏犅培养基蛋白胨２０ｇ，甘油１０ｇ，硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）１．５ｇ，磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）１．５ｇ，琼脂１５ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。调整ｐＨ值至７．２，１２１℃湿热灭菌２０ｍｉｎ。犅．２ ５２３培养基蛋白胨８ｇ，酵母粉４ｇ，硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）０．３ｇ，蔗糖（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）１０ｇ，磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）２ｇ，琼脂１８ｇ，水（Ｈ２Ｏ）１０００ｍＬ。调整ｐＨ值至７．０～７．１，１２１℃湿热灭菌２０ｍｉｎ。犅．３ 犕犛犘培养基蛋白胨５ｇ，硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ）０．０２５ｇ，蔗糖（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）２０ｇ，磷酸氢二钾（Ｋ２ＨＰＯ４）０．５ｇ，琼脂２０ｇ，水（Ｈ２Ｏ）１０００ｍＬ。调整ｐＨ值至７．２～７．４，１２１℃湿热灭菌２０ｍｉｎ，之后冷却到４５℃，加入下列经过细菌滤膜过滤的试剂：放线菌酮（１００ｍｇ／ｍＬ，用７５％的甲醇溶解） ２ｍＬ头孢氨苄（１０ｍｇ／ｍＬ，用水溶解）８ｍＬ万古霉素（１０ｍｇ／ｍＬ，用水溶解）１ｍＬ溴百里酚蓝（１５ｍｇ／ｍＬ，用９５％的酒精溶液溶解）１ｍＬ犅．４ 选择性培养基上的菌落形态特征菜豆晕疫病菌在ＭＳＰ培养基上形成圆形、边缘整齐的黄色菌落，４８ｈ菌落直径在１ｍｍ～１．５ｍｍ，典型的特征是生长期间有浅蓝色色素产生，３６６ｎｍ紫外光下观察有蓝色荧光，并扩散到培养基中。犅．５ 普通培养基上的菌落形态特征菜豆晕疫病菌在５２３培养基上形成圆形、黄绿色菌落，４８ｈ菌落直径在１ｍｍ～１．５ｍｍ（随转接代数增加，菌株的生长速度会加快），边缘整齐，典型的特征是生长期间有浅黄绿色素产生，并扩散到培养基中。菜豆晕疫病菌在金氏Ｂ培养基上的菌落形态与５２３培养基类似，但菌落颜色较５２３稍浅。５犛犖／犜１５８６．２—２００８附 录 犆（规范性附录）菜豆晕疫病菌（犘狊犲狌犱狅犿狅狀犪狊狊犪狏犪狊狋犪狀狅犻狆狏．狆犺犪狊犲狅犾犻犮狅犾犪）的犘犆犚检测方法犆．１ 试剂制备犆．１．１ ＴＡＥ电泳缓冲液（５０×储存液，ｐＨ约８．５）：２４２ｇＴｒｉｓ碱，５７．１ｍＬ冰乙酸，３７．５ｇＮａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ加Ｈ２Ｏ至１Ｌ，用时蒸馏水稀释５０倍。犆．１．２ ＴＥ缓冲液：１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·Ｃｌ，ｐＨ８．０，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡｐＨ８．０犆．２ 犘犆犚反应模板制备可直接用培养的菌株稀释成菌悬液（＞１０７ＣＦＵ／ｍＬ）作为ＰＣＲ反应模板。１）犆．３ 定性犘犆犚检测犆．３．１ 检测引物Ｐ１：５’ＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＡＡＡＡＣＡＣＣＴＧＣＰ２：５’ＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＣＡＴＧ（扩增产物０．５ｋｂ）犆．３．２ 犘犆犚反应体系（３０μ犔）１０×ＰＣＲ缓冲液 ３μＬｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌｅａｃｈ）１．２μＬ引物Ｐ１（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ引物Ｐ２（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１μＬ犜犪狇（５Ｕ／μＬ）０．２μＬＨ２Ｏ２２．６μＬ模板ＤＮＡ１μＬ犆．３．３ 犘犆犚反应程序９４℃／３ｍｉｎ；９４℃／３０ｓ；６０℃／３０ｓ；７２℃／４０ｓ；３８循环；７２℃／５ｍｉｎ；４℃。犆．３．４ 犘犆犚扩增产物的检测１．５％的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪下进行分析并拍照，记录实验结果。１） 可按《精编分子生物学实验指南》中的方法提取细菌基因组ＤＮＡ，提取后可用ＴＥ缓冲液溶解，－２０℃保存。６犛犖／犜１５８６．２—２００８