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进出口食品中沙门氏菌滤膜筛选法Salmonellainfoodforimportandexport—MembramefilterscreeningmethodSN/T1059.1—2002前 言 本标准是按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》进行编写的。 本标准中沙门氏菌滤膜筛选法中的培养基、培养温度和滤膜法等内容是参考美国公职分析化学家协会(AOAC)《公定分析方法》(1995年第16版17.9.09)样品制备，采用SN0170—1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》，并在实验的基础上编写而成。 本标准的附录A是标准的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国天津出入境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人：陈子红、侯丽萍、唐丹舟、张思传、孙俐。 本标准首次发布。1范围 本标准规定了进出口食品中沙门氏菌滤膜筛选法。 本标准仅适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、单晶糖、牛奶、饮料、禽肉、椒粒中沙门氏菌筛选。2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 SN0170—1992出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法 SN0330—1994出口食品中微生物学检验通则3抽样 按SN0330规定执行。4试验方法4.1方法原理 将滤膜放入滤器，过滤样品。由于滤膜的作用而使沙门氏菌保留在膜表面上。将滤膜放在EF-18培养基上培养，沙门氏菌形成绿色、蓝绿色、蓝色或黄色菌落。4.2设备和材料4.2.1滤器：一套，备有预滤器。4.2.2真空泵。4.2.3滤膜：有机或水相，孔径0.45μm。4.2.4培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃。4.2.5水浴箱：45℃±1℃，37℃±1℃。4.2.6吸管：1mL、10mL，具刻度。4.2.7玻璃三角瓶和广口瓶：250mL、500mL。4.2.8试管：17mm×170mm，玻璃制。4.2.9玻璃珠：直径5mm。4.2.10平皿：直径90mm。4.2.11天平：感量0.1g。4.2.12均质器。4.3培养基和试剂4.3.1蛋白胨-吐温80(PT)稀释液(见附录AA1)。4.3.2四硫磺酸盐肉汤(加碘和煌绿)(见附录AA2)。4.3.3EF-18琼脂(见附录AA3)。4.4样品制备及增菌培养4.4.1如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或在2℃～5℃不超过18h解冻。若不能及时检验，应置于-15℃左右保存。非冷冻而易腐的食品，置于4℃冰箱保存。4.4.2以无菌操作，称取25g(mL)样品，置于灭菌均质杯内，加入25mLPT稀释液，以8000～10000r/min均质1min，放入装有200mLPT稀释液的500mL灭菌广口瓶，混合均匀，如pH低于6.6，用灭菌1mol/L氢氧化钠溶液，调pH至6.8±0.2，放入37℃水浴培养4h(以增菌液达到37℃时算起)，进行前增菌；其后，移取10mL转种于盛有100mL四硫磺酸盐肉汤(加碘和煌绿)的250mL灭菌广口瓶内，摇匀，42℃±1℃培养20h±2h，进行选择性增菌。4.5过滤和培养 将灭菌的过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上，用不锈钢夹子固定。以无菌操作加10mL～20mL无菌蒸馏水于滤器中，用灭菌吸管取选择性增菌液1mL放入滤器中，打开真空泵抽吸液体。再加入10mL～15mL无菌蒸馏水抽取液体，抽干后关闭真空泵，打开底座夹，以无菌镊子取出滤膜，将滤膜移至预先干燥好EF18琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡，在42℃±1℃培养18～24h，无菌落生长则为阴性。4.6典型或可疑菌落的鉴定 典型沙门氏菌菌落既不是水滴样又不是粘液状，一般呈绿色、翡翠绿色或蓝绿色，有时呈蓝色(赖氨酸阳性菌和蔗糖阴性菌)和黄色(赖氨酸阴性菌和蔗糖阳性菌)。 从平板上挑选3个典型或可疑菌落，按照SN0170—1992中第4章进行生化和血清学鉴定。5报告结果5.1报告阳性结果：“沙门氏菌检出/25g”。5.2报告阴性结果：“沙门氏菌未检出/25g”。附录A(标准的附录)培养基和试剂A1蛋白胨-吐温80(PT)稀释液将上述成分加热溶解，于121℃高压灭菌15min。A2四硫磺酸盐肉汤(加碘和煌绿)A2.1基础肉汤制备a)蛋白胨1.0gb)吐温8010.0gc)蒸馏水1000mL a)多价蛋白胨5.0g b)胆盐1.0g c)碳酸钙10g d)硫代硫酸钠(5个分子水)30g e)蒸馏水1000mL 将上述成分混合加热煮沸(沉淀不会完全溶解)，冷却至45℃储存于冰箱(5℃～8℃)内备用。A2.2碘-碘化钾溶液制备 将5g碘化钾溶解于5mL灭菌蒸馏水中，加入6g碘溶解后，用灭菌蒸馏水稀释至20mL备用。A2.3煌绿溶液制备 称取煌绿染料0.1g溶解于灭菌的蒸馏水中并稀释至100mL，备用。A2.4使用 在使用的当天，将20mL碘碘化钾溶液，10mL煌绿溶液加入1000mL基础肉汤中，缓慢震荡将沉淀悬浮起来。并以无菌操作以10mL分装于17mm×170mm灭菌的试管内，不要加热，使用前保持温度在25℃～35℃。A3EF-18琼脂 加热搅拌至煮沸，完全溶解。本培养基不需高压灭菌，冷却至45℃～50℃。配制新生霉素溶液，溶解0.15g新生霉素于10mL水中，用0.45μm滤膜过滤除菌。于保温的1000mLEF18琼脂基础中加入1.0mL除菌的新生霉素溶液，混匀。将培养基倾注于陪替氏皿中，每皿20mL，凝固后培养基的最终pH应为6.8±0.1。未使用的新生霉素于4℃～6℃，贮存备用。 注意：正确调节pH是该培养基效能的关键。用平面探头测定固体培养基pH。也可在倾注陪替氏平皿前，以无菌操作，用灭菌的1mol/L盐酸或氢氧化钠调节pH至6.6±0.1。 a)蛋白胨5.0g b)酵母浸膏3.0g c)L-赖氨酸盐酸盐10.0g d)D-葡萄糖2.5g e)蔗糖15g f)硫酸镁(MgSO4·7H２Ｏ)1.5g g)胆盐1.5g h)磺胺吡啶0.3g i)溴麝香草酚蓝钠盐0.03g j)琼脂15.0g k)蒸馏水1000mL