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进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法Totalcoliformandescherichiacolicountsinfoodforimportandexport—Membranefilter/MUGmethodSN/T1059.2—2002前 言 本标准是按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》进行编写的。其中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法的培养基、培养温度和滤膜法等内容，是参考美国公职分析化学家协会(AOAC)《公定分析方法》(1995年第16版17.3.09)，结合SN0169—1992《出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法》中样品制备并在实验的基础上编写的。 本标准的附录A是标准的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国天津出入境检验检疫局负责起草。 本标准起草人：陈子红、侯丽萍、唐丹舟、张思传、孙俐。 本标准首次发布。1范围 本标准规定了进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法。 本标准仅适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、单晶糖、饮料、椒粒、牛奶(需用蛋白酶处理)中大肠菌群、大肠杆菌的计数滤膜/MUG法检验。2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 SN0330—1994出口食品中微生物学检验通则3抽样 按SN0330规定执行。4检验方法4.1方法原理 将滤膜放入滤器，过滤样品，由于滤膜的作用，大肠菌群、大肠杆菌保留在膜表面。大肠菌群在乳糖莫能霉素葡萄糖醛酸(LMG)琼脂平板上经培养后产生蓝色菌落。大肠杆菌经培养后产生的葡萄糖苷能降解荧光底物4甲基伞形酮βD葡萄糖苷酸(MUG)并释放4甲基伞形酮荧光物质，在波长366nm长波紫外光(UV)灯下MUG阳性菌落呈蓝白色荧光。4.2设备和材料4.2.1滤器：一套，备有预滤器。4.2.2真空泵。4.2.3长波紫外光(UV)灯：波长366nm。4.2.4滤膜：有机或水相，孔径0.45μm。4.2.5培养箱：36℃±1℃。4.2.6水浴箱：45℃±1℃。4.2.7吸管：1mL、10mL，具刻度。4.2.8玻璃三角瓶和广口瓶：500mL。4.2.9试管：17mm×170mm，玻璃制。4.2.10玻璃珠：直径5mm。4.2.11平皿：直径90mm。4.2.12天平：感量0.1g。4.2.13均质器。4.2.14乳钵和研棒。4.3培养基和试剂4.3.1蛋白胨-吐温80(PT)稀释液(见附录AA1)。4.3.2乳糖莫能霉素葡萄糖酸琼脂(LMG)(见附录AA2)。4.3.3缓冲MUG琼脂(BMA)(见附录AA3)。4.3.4三(羟甲基)胺甲烷(Tris)缓冲剂(见附录AA4)。4.3.5胰蛋白酶贮存液(见附录AA5)。4.4样品制备4.4.1以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2℃～5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。4.4.2样品匀液的制备4.4.2.1液体食品 以灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mLPT稀释液的500mL灭菌广口瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，以80cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1∶10的样品匀液。4.4.2.2固体和半固体食品 以无菌操作取25g样品，放入装有225mLPT稀释液的灭菌均质杯内，于8000r/min均质1min～2min，制成1∶10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。4.4.3稀释样品匀液 根据对样品污染情况的估计，用PT稀释液将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10－２、１０－３、１０－４……。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。4.4.4需要酶处理的食品 取1∶10PT稀释液10mL加酶原液1mL，在灭菌试管中混合放入36℃±1℃水浴中处理20min～30min，取出过滤。4.5过滤 对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，每个稀释度的样液分别过滤两次，将灭菌的过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上，用不锈钢夹子固定。以无菌操作加10mL～20mL无菌蒸馏水于滤器中，加入PT样品匀液10mL，打开真空泵，抽吸过滤，再加入10mL～15mL无菌蒸馏水，抽吸过滤，关闭真空泵。用无菌镊子将滤膜取出。4.6计数4.6.1大肠菌群计数 以无菌操作将滤膜取出放于预先干燥的LMG琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入36℃±1℃培养箱培养24h±2h。选用25～250个菌落的平板，计数所有蓝色(包括深或浅蓝色)的菌落。滤膜上的菌落数乘以稀释倍数即为每克(毫升)〔g(mＬ)〕食品中大肠菌群数。4.6.2大肠杆菌计数 将有大肠菌群的滤膜放入预先干燥好的BMA琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入36℃±1℃培养箱培养2h，在暗室或紫外操作室内用波长366nmUV灯观察滤膜上的菌落是否有蓝白色荧光。选用25～250个菌落数的平板，计算所有带蓝白色荧光的菌落数，乘以稀释倍数即为每克(毫升)〔g(mL)〕食品中大肠杆菌数。附录A(标准的附录)培养基和试剂A1蛋白胨-吐温80(PT)稀释液 将上述成分加热溶解分装90mL于三角瓶中，121℃，15min高压灭菌。A2乳糖莫能霉素葡萄糖醛酸琼脂(LMG) 加热煮沸，不能高压消毒，温度冷至45℃～50℃无菌操作，调整pH最终为7.2±0.1。倾注平板，打开皿盖在35℃温箱，15min～20min烘干备用。A3缓冲MUG琼脂(BMA) 溶解加热煮沸，调整pH7.2～7.6，121℃，15min高压灭菌。温度冷至45℃～50℃，倾注平板。A4Tris缓冲剂(1.0mol/L)。溶解121.1g三(羟甲基)胺甲烷于500mL水中，用浓盐酸调节溶液至所需pH值。用水稀释至1L。室温4℃～6℃保存。A5胰蛋白酶贮存液：用Tris缓冲剂稀释10g胰蛋白酶(DoifcoNo.0153或等效品)至100mL，pH7.6。如需要加热至35℃以助溶，通过WhatmanNo.1滤纸(或等效品)过滤以除去不溶物质，再用0.45μm滤膜过滤除菌。于4℃～6℃保存一周或-18℃保存3个月。 a)蛋白胨1.0g b)吐温8010.0g c)蒸馏水1000mL a)胰蛋白胨10.0g b)蛋白胨5.0g c)酵母膏3.0g d)乳糖12.5g e)莫能霉素0.038g(溶解在10mL95%酒精里) f)苯胺蓝0.1g g)葡萄糖醛酸钠盐0.5g h)硫酸十七烷基钠盐0.25mL i)琼脂15g j)蒸馏水1000mL a)磷酸氢二钠8.23g b)磷酸二氢钠1.20g c)氯化钠5.0g d)4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷酸(MUG)0.1g e)琼脂15.0g f)蒸馏水1000mL