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进出口食品平板菌落计数滤膜法Platecountforbacterialcoloniesinfoodforimportandexport—MembranefiltermethodSN/T1059.3—2002前 言 本标准是按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》进行编写的。其中平板菌落计数滤膜法中的培养基、培养温度和滤膜法等内容是参考美国公职分析化学家协会(AOAC)《公定分析方法》(1995年第16版17.2.05)，结合SN0168—1992《出口食品平板菌落计数》样品制备中内容，并在实验的基础上编写而成。 本标准的附录A是标准的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国天津出入境检验检疫局负责起草。 本标准主要起草人：陈子红、侯丽萍、唐丹舟、张思传、孙俐。 本标准首次发布。1范围 本标准规定了进出口食品中平板菌落计数滤膜法。 本标准仅适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、单晶糖、饮料、辣椒粒、牛奶(需用胰蛋白酶处理)中菌落计数的检验。2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。 本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 SN0330—1994出口食品中微生物学检验通则3抽样 按SN0330规定执行。4检验方法4.1方法原理 将滤膜放入滤器，过滤样品，使细菌留在膜表面。将滤膜放在胰化大豆坚牢绿琼脂(TSFA)培养基上培养，产生深、浅绿色菌落，进行计数。4.2设备和材料4.2.1滤器：一套，备有预滤器。4.2.2真空泵。4.2.3滤膜：有机或水相，孔径为0.45μm。4.2.4培养箱：36℃±1℃。4.2.5水浴箱：35℃±1℃。4.2.6吸管：1mL、10mL，具刻度。4.2.7玻璃三角瓶和广口瓶：200mL，500mL。4.2.8试管：17mm×170mm，玻璃制。4.2.9玻璃珠：直径5mm。4.2.10平皿：直径90mm。4.2.11天平：感量0.1g。4.2.12均质器。4.3培养基和试剂4.3.1蛋白胨-吐温80(PT)稀释液(见附录AA1)。4.3.2胰化大豆-坚牢绿琼脂(TSFA)(见附录AA2)。4.3.3三(羟甲基)胺甲烷Tris缓冲剂(见附录AA3)。4.3.4胰蛋白酶贮存液(见附录AA4)。4.4样品制备4.4.1以无菌操作取有代表性的样品盛于灭菌容器内。如有包装，则用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。4.4.2样品匀液制备4.4.2.1固体或半固体食品：以无菌操作取25g样品，放入装有225mL PT稀释液的灭菌均质杯内，于8000 r／min，均质1min～2min，制成1∶10的样品匀液。如样品均质时间超过2min，应在均质杯外加冰水冷却。4.4.2.2干燥或干粉食品：以无菌操作取25g样品，放入装有225mL PT稀释液的500mL灭菌广口瓶中（瓶内预置适当数量的玻璃珠）。迅速振摇，将样品混匀，制成1∶10的样品匀液。振摇时，幅度30cm，7s内振摇25次，也可用机械振荡器振荡15s代替手摇。4.4.2.3液体食品：用灭菌吸管吸取25mL样品，放入装有225mLPT稀释液的500mL的灭菌广口瓶中，按4.4.2.2条中所述的方法，迅速振摇，制成1∶10的样品匀液。吸取样品时，吸管插入液面下不要超过2.5cm。吸管内液体要在2s～4s内完全排入稀释液中。不要在稀释液中吹洗吸管。4.4.3稀释样品匀液4.4.3.1用10mL灭菌吸管准确吸取1∶10的样品匀液10mL放入装有90mL PT稀释液的200mL灭菌广口瓶中。按4.4.2.2中所述的方法，迅速振摇，制成1∶100的样品液。4.4.3.2分别用10mL灭菌吸管按4.4.3.1条所述方法将样品匀液制成10倍递增PT稀释液的样品液如10－3、10－４、10－５……4.4.4酶处理的食品 需要酶处理的食品取1∶10 PT样品匀液10mL加酶原液1mL，在灭菌试管中混合放入35℃±1℃水浴中处理20min～30min，取出过滤。4.5过滤 对每一份试样，选用适宜的三个连续稀释度的样液，每个稀释度的样液分别过滤两次。将灭菌的过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上，用不锈钢夹子固定。以无菌操作加10mL～20mL无菌蒸馏水于滤器中，加入PT样品匀液10mL，打开真空泵，抽吸过滤，再加入10mL～15mL无菌蒸馏水，抽吸过滤，关闭真空泵。用无菌镊子将滤膜取出。4.6培养 以无菌操作将滤膜取出放于预先干燥的TSFA琼脂平板表面上，滤膜和琼脂表面之间应无气泡。将TSFA琼脂平板，平放入36℃±1℃培养箱内培养48h。4.7计数4.7.1培养后，对每个TSFA琼脂平板上产生的深、浅绿色菌落进行计数。25～250个菌落为合适范围。如果不能立即计数，应将平板存放于0℃～4℃，但不得超过24h。4.7.2如只有一个稀释度的两个平板上的菌落在合适范围内，先计算两个平板的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克(毫升)〔g(mL)〕样品中平板菌数。4.7.3如有两个稀释度在合适范围内，先计算每个稀释度两个平板的平均值。再计算两个稀释度的平均值，然后计算每克(毫升)〔g(mL)〕样品中平板菌落数。4.7.4当最低稀释度的两个平板上都少于25个菌落时，计数这一稀释度两个平板上的实际菌落数。计算两个平板上的平均菌落数，将平均菌落数乘以稀释倍数，得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号（*），表明该数系从菌落数在25～250这一范围之外的平板估计所得。4.7.5当所有平板上的菌落都超过250时，则应将最高稀释度的两个平板的平均菌落数乘以稀释倍数。得到估计的平板菌落数。给这个数注上星号（*）（同4.7.4）。4.7.6如果所有稀释度的平板都没有菌落，则以小于1乘以最低稀释倍数报告平板菌落数。给这个数注上星号（*）（同4.7.4）。4.7.7同一稀释度的两个平板中，一个有25～250个菌落，另一个的菌落多于250个，两个平板都要计数。计算方法同4.7.2。4.7.8两个连续稀释度中的每个稀释度都有一个平板的菌落数在25～250个范围内，而另一个的菌落数高于250或低于25四个平板都要计数。计算方法参照4.7.2和4.7.3。4.7.9某稀释度的两个平板都有25～250个菌落，而另一稀释度的两个平板中只有一个平板的菌落数在25～250范围内。四个平板都要计数，计算方法参照4.7．2和4.7.3。5结果报告 报告每克(毫升)〔g(mL)〕样品中平板菌落数或估计数的平板菌落数。附录Ａ（标准的附录）培养基和试剂A1蛋白胨-吐温80(PT)稀释液 将上述成分加热溶解分装90mL于三角瓶中，121℃高压灭菌15min。A2胰化大豆-坚牢绿琼脂(TSFA) 将上述成分加热溶解分装，121℃高压灭菌15min，调整最终pH为7.3。A3(Tris)缓冲剂(1.0mol/L)。溶解121.1g三(羟甲基)胺甲烷于500mL水中，用浓盐酸调节溶液至所需pH值。用水稀释至1L。室温或4℃～6℃保存。A4胰蛋白酶贮存液：用Tris缓冲剂稀释10g胰蛋白酶(DoifcoNo.0153或等效品)至100mL，pH7.6。如需要加热至35℃以助溶，通过WhatmanNo.1滤纸(或等效品)过滤以除去不溶物质，再用0.45μm滤膜过滤除菌。于4℃～6℃保存一周或-18℃保存3个月。 a)蛋白胨1.0g b)吐温8010.0g c)蒸馏水1000mL a)蛋白胨15.0g b)植物蛋白胨(或大豆胨)5.0g c)氯化钠(NaCl)5.0g d)坚牢绿0.25g e)琼脂15g f)蒸馏水1000mL