搜索
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜０７６２—２０１１猪瘟病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狉犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚犳狅狉犱犲狋犲犮狋犻狅狀狅犳犮犾犪狊狊犻犮犪犾狊狑犻狀犲犳犲狏犲狉狏犻狉狌狊２０１１０５２０发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准猪瘟病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法ＳＮ／Ｔ０７６２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１７千字２０１１年１１月第一版 ２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５９３ 定价１６．００元书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市复星医学科技发展有限公司。本标准主要起草人：李春阳、刘俊平、熊炜、单松华、黄忠荣、夏懿、胡永强、李树清、王巧全。Ⅰ犛犖／犜０７６２—２０１１猪瘟病毒荧光犚犜犘犆犚检测方法１ 范围本标准规定了猪瘟病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测的操作方法。本标准适用于猪及其产品中猪瘟病毒的检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。荧光ＲＴＰＣＲ：荧光反转录聚合酶链式反应Ｃｔ值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数ＲＮＡ：核糖核酸ＤＥＰＣ：焦碳酸乙二酯犜犪狇酶：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶４ 原理猪瘟病毒是有囊膜的正链ＲＮＡ病毒。根据猪瘟病毒不同分离株基因的保守序列，设计一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。探针与病毒基因的保守序列结合，其结合部位位于引物扩增区域内。探针的５’端标记ＦＡＭ荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接收，称为报告荧光基团（用Ｒ表示），３’端标记ＴＡＭＲＡ荧光素，它在近距离内能吸收５’端报告荧光基团发出的荧光信号，称为淬灭荧光基团（用Ｑ表示）。ＰＣＲ反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上Ｒ基团发出的荧光信号被Ｑ基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；ＰＣＲ反应进行到延伸阶段时，犜犪狇酶发挥其５’→３’外切核酸酶的功能将探针酶切水解，与此同时标记在探针上的Ｒ基团游离出来，Ｒ所发出的荧光不再为Ｑ所吸收而被检测仪所接收。随着ＰＣＲ反应的进行，ＰＣＲ产物与荧光信号的增长呈对应关系。５ 设备、材料和试剂５．１ 设备、材料５．１．１ 荧光ＰＣＲ检测仪。５．１．２ 高速台式冷冻离心机（离心速度１２０００犵以上）。５．１．３ 普通台式离心机（离心速度３０００犵）。１犛犖／犜０７６２—２０１１５．１．４ 匀浆器。５．１．５ 冰箱（２℃～８℃，－２０℃，－７０℃三种）。５．１．６ 微量可调移液器（０μＬ～２μＬ，１μＬ～１０μＬ，１０μＬ～１００μＬ，２０μＬ～２００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ）及配套带滤芯无ＲＮＡ酶的吸头。５．１．７ 水浴锅（５６℃，７０℃）。５．１．８ 高压锅。５．１．９ 无ＲＮＡ酶的（离心）管（１．５ｍＬ，０．２ｍＬ）。５．２ 试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无ＲＮＡ酶污染的容器（用ＤＥＰＣ水处理后高压灭菌）分装。试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。５．２．１ 异丙醇。５．２．２ 犜犪狇ＤＮＡ酶。５．２．３ ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。５．２．４ 逆转录酶。５．２．５ ７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，－２０℃预冷。５．２．６ ＲＮＡ核酸提取试剂盒１）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ａ。５．２．７ 猪瘟病毒荧光ＲＴＰＣＲ检测试剂盒２）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ｂ。６ 样品的采集与前处理６．１ 总则采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。６．２ 采样工具及其要求６．２．１ 剪刀、镊子、滴管、离心管、匀浆器。６．２．２ 所有上述采样工具应经１２１℃±２℃，１５ｍｉｎ高压灭菌并烘干或经１６０℃干烤２ｈ以上。６．３ 样品采集和处理６．３．１ 肌肉或组织脏器取待检样品２．０ｇ置于匀浆器中，加入１０ｍＬＰＢＳ匀浆，然后将组织悬液转入离心管中３０００犵离心１０ｍｉｎ取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。６．３．２ 血清或血浆用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。６．３．３ 病毒培养物用无菌滴管直接吸取至无菌离心管中，编号备用。１） 由上海市复星医学科技发展有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。２） 由上海出入境检验检疫局提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。２犛犖／犜０７６２—２０１１６．４ 样品贮运样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品，放一个塑料袋，于保温箱中加冰、密封，送实验室。采集或处理的样本在２℃～８℃条件下保存应不超过２４ｈ；若需长期保存，应放置－７０℃冰箱，冻融不超过３次。７ 操作方法７．１ 检测环境要求见附录Ｃ。７．２ 样本核酸的提取７．２．１ 在样本制备区进行。取狀个灭菌的１．５ｍＬ离心管，其中狀为被检样品、阴性对照数量的和（阴性对照在试剂盒中已标出），编号。７．２．２ 每管加入２００μＬＬＢ，分别加入被检样本、阴性对照各２００μＬ，一份样本换用一个吸头，再加入５０μＬ蛋白酶Ｋ，立即振荡混匀，７２℃保温裂解１０ｍｉｎ。７．２．３ 在保温后的溶液中加入１００μＬ异丙醇，振荡混匀后转移到柱式制备／离心管中，１００００犵离心１ｍｉｎ，弃管底滤液。７．２．４ 在制备管中加入ＷＢ１溶液５００μＬ，１００００犵离心１ｍｉｎ，弃管底滤液。７．２．５ 在制备管中加入ＷＢ２溶液５００μＬ，１００００犵离心１ｍｉｎ，弃管底滤液。７．２．６ 将制备管１３０００犵离心１ｍｉｎ，彻底去除残余的ＷＢ２溶液。７．２．７ 将制备柱取出，并放置于一个新的离心管中，加入预先预热到７０℃的ＥＢ溶液５０μＬ，５６℃放置２ｍｉｎ。７．２．８ １００００犵离心１ｍｉｎ，收集管底的离心滤液至无ＲＮＡ酶的离心管中，即得样本ＲＮＡ溶液。提取的ＲＮＡ溶液应在２ｈ内进行ＰＣＲ扩增检测，否则应保存于－７０℃冰箱。７．３ 检测步骤７．３．１ 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出荧光ＲＴＰＣＲ缓冲液、混合酶、荧光探针、氯化镁，在室温下融化后，２０００犵离心５ｓ。设所需荧光ＲＴＰＣＲ检测总数为狀，其中狀为被检样品、阴性对照、阳性校准品的和，按样品数狀取荧光ＲＴＰＣＲ缓冲液狀×１８μＬ、氯化镁狀×３μＬ、荧光探针狀×３μＬ、混合酶狀×２μＬ于一离心管中，混匀后按每管２６μＬ分装，转移至样本处理区。７．３．２ 加样在样本处理区进行。在各设定的荧光ＲＴＰＣＲ管中分别加入上述样本处理步骤７．２．８中制备的ＲＮＡ溶液及试剂盒提供的阳性校准品各４μＬ，盖紧管盖，５００犵离心３０ｓ。７．３．３ 荧光犚犜犘犆犚检测在检测区进行。将本标准７．３．２中离心后的ＰＣＲ管放入荧光ＰＣＲ检测仪内，记录样本摆放顺序。３犛犖／犜０７６２—２０１１第一阶段，反转录４２℃，３０ｍｉｎ。第二阶段，预变性９４℃，２ｍｉｎ。第三阶段，变性９４℃，５ｓ，退火５５℃，１０ｓ，延伸６５℃，３０ｓ，４０个循环；在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。根据收集的荧光曲线和Ｃｔ值判定结果。８ 结果判定８．１ 结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。８．２ 阴性对照判定无Ｃｔ值并且无扩增曲线。８．３ 阳性对照判定阳性校准品呈现出典型的阳性扩增曲线。８．４ 样品结果判定８．４．１ 阴性无Ｃｔ值或Ｃｔ＞３８，表示样品中无猪瘟病毒核酸。８．４．２ 阳性Ｃｔ≤３５，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪瘟病毒核酸。８．４．３ 有效原则３５＜Ｃｔ≤３８的样本建议复检；复检后，若Ｃｔ值仍然≤３５表示样品中存在猪瘟病毒核酸，若Ｃｔ值无或＞３５表示样品中无猪瘟病毒核酸。４犛犖／犜０７６２—２０１１附 录 犃（资料性附录）犚犖犃提取试剂盒的组成犃．１ 试剂盒组成每个试剂盒可做２０个检测，包括以下成分：———细胞裂解缓冲液（ＬＢ），４ｍＬ；———清洗缓冲液１（ＷＢ１），１０ｍＬ；———清洗缓冲液２（ＷＢ２），１０ｍＬ；———洗脱缓冲液（ＥＢ），１ｍＬ；———柱式制备管，２０个；———离心塑料管，４０个；———多聚腺苷酸［Ｐｏｌｙ（Ａ）］，４ｍｇ／ｍＬ，４０μＬ；———蛋白酶Ｋ（ＰｒｏｔｅａｓｅＫ），１８ｍｇ／ｍＬ，１ｍＬ。犃．２ 说明犃．２．１ ＷＢ１第一次使用前在每３３ｍＬ中加入２０ｍＬ无水乙醇，充分混匀后拧紧盖子、室温保存。犃．２．２ ＷＢ２第一次使用前在每１０ｍＬ中加入４０ｍＬ无水乙醇，充分混匀后拧紧盖子、室温保存。犃．３ 功能试剂盒可用于临床相关样品（包括组织、脏器、拭子、血清或血浆等）中核酸的提取。犃．４ 使用时的注意事项犃．４．１ 蛋白酶Ｋ不得直接加入细胞裂解缓冲液中，以免失活。犃．４．２ 不容易裂解的样品可适当加大细胞裂解缓冲液的体积和蛋白酶Ｋ的用量比，同时也应按照比例增加异丙醇用量，但清洗缓冲液１和清洗缓冲液２用量不变，最后延长保温裂解时间。犃．４．３ 样品中细胞或病毒粒子浓度较低时可减少洗脱缓冲液的体积，例如３０μＬ，但要保证加到膜中央并能将膜浸润。５犛犖／犜０７６２—２０１１附 录 犅（资料性附录）猪瘟病毒荧光犚犜犘犆犚检测试剂盒犅．１ 试剂盒组成每个试剂盒可做３２个检测，包括以下成分：———荧光ＲＴＰＣＲ缓冲液，６００μＬ；———混合酶，６４μＬ；———荧光探针，１００μＬ；———ＭｇＣｌ２，１００μＬ；———阳性校准品，３０μＬ；———阴性对照，１００μＬ。犅．２ 说明犅．２．１ 荧光探针外观为红色液体，需避光保存。犅．２．２ 混合酶含有逆转录酶和犜犪狇酶。犅．２．３ 荧光ＲＴＰＣＲ缓冲液中含有特异性引物及各种离子。犅．３ 功能试剂盒可用于猪及其相关产品中猪瘟病毒的检测。犅．４ 使用时的注意事项犅．４．１ 在检测过程中，应严防不同样品间的交叉污染。犅．４．２ 反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。６犛犖／犜０７６２—２０１１附 录 犆（规范性附录）检测环境要求犆．１ 实验室设置要求犆．１．１ 实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物配制区和检测区。犆．１．２ 工作区域应有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。犆．１．３ 每一工作区域应有专用的仪器设备。犆．１．４ 整个实验过程中均应使用无ＲＮＡ酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须１６０℃干烤４ｈ以上，以彻底去除ＲＮＡ酶。犆．１．５ 各区域的仪器设备应有明确标记，以避免设备物品从各自的区域内移出，造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。犆．１．６ 进入各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、反应混合物配制区至检测区。犆．１．７ 在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别；离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出。犆．１．８ 实验室清洁时应按样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区的顺序进行。犆．１．９ 不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。犆．２ 各工作区域功能及注意事项犆．２．１ 样本制备区的功能及注意事项犆．２．１．１ 标本的保存、核酸提取、贮存及其