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实验九流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期时相杭州师范大学刘姬艳一、实验目的1、了解流式细胞术（FCM，FlowCytometry）的基本原理。2、了解流式细胞术分析细胞凋亡的检测方法。3、了解流式细胞术分析细胞群体DNA含量分布的基本方法。二、实验原理●细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞基因调控的一种自主性的自杀现象。或者说在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控的死亡过程，因此又称之为程序性细胞死亡(ProgrammedCellDeath)。●细胞凋亡有别于细胞坏死（necrosis）。二、实验原理（continued）细胞凋亡检测方法基于形态学观察的染色法基于DNA片断化的检测法膜联蛋白检测法Caspase酶分析法流式细胞仪定量分析法二、实验原理（continued）●流式细胞术（FCM，FlowCytometry）：是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定性,定量分析与分选的一门技术。●FCM是利用流式细胞仪(FlowCytometer)分析在高压高速下通过样品孔径的单个细胞,在激光束的照射下的发出的散射光和与细胞表面结合的荧光标记的单抗的荧光信号。二、实验原理（continued）●细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2n，而G2期的DNA含量是4n。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。流式细胞仪-GuavaEasycyte8HT二、实验原理（continued）二、实验原理（continued）二、实验原理（continued）二、实验原理（continued）二、实验原理（continued）二、实验原理（continued）二、实验原理（continued）二、实验原理（continued）二、实验原理二、实验原理二、实验原理仪器：流式细胞仪，细胞培养设备，离心机，水浴，冰箱材料：Hep-2细胞，离心管，封口膜，微量移液器，Tips试剂：70％乙醇（保存于4℃），RNase-A（10mg/ml,-20℃保存），PI（650µg/ml，避光保存于-20℃），PBS(pH7.4，保存于4℃)三、仪器、材料与试剂1.收集对数生长期细胞接种于6孔培养板中，每孔1.9mL（含4×105细胞）。2.培养过夜后，加入不同浓度的药液100μL，对照组加入同体积的高糖DMEM液。3.作用不同的时间后，离心收集细胞，PBS洗涤2次，体积分数为0.70的乙醇-20℃固定24h以上。4.离心洗去乙醇，细胞重悬于PBS中，1,500r/min，离心5min去PBS后加PI染色液，室温下避光染色30min。5.400目筛网过滤，采用GuavaEasycyte8HT流式细胞仪，以氩离子激光器为激发光源，激发波长为488nm，测定数据输入计算机，用Multicycle软件分析细胞DNA含量。四、实验步骤五、实验结果五、实验结果五、实验结果