搜索
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８４７—２０１１水貂阿留申病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犪犾犲狌狋犻犪狀犱犻狊犲犪狊犲狅犳犿犻狀犽２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中国农业科学院特产研究所。本标准主要起草人：王伟利、孟庆峰、柏亚铎、肖成蕊、孟日增、石建平、姜焱、宋战昀、闫喜军、刘和平、罗雁非、王振国。Ⅰ犛犖／犜２８４７—２０１１水貂阿留申病检疫技术规范１ 范围本标准规定了水貂阿留申病的检疫技术规范，包括病原分离鉴定、对流免疫电泳、ＰＣＲ及荧光ＰＣＲ等鉴别诊断技术。本标准适用于进出境水貂的阿留申病检疫、疫情监测和流行病学调查。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 临床诊断３．１ 概况水貂阿留申病（ａｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）又称浆细胞增多症，是一种由主要侵害水貂免疫细胞的阿留申病毒（ａｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＡＤＶ）引起的，导致自身免疫系统紊乱并逐渐衰竭，同时并发强烈的自身免疫的慢性传染性疾病。３．２ 发病症状病貂精神沉郁，嗜睡，渴欲猛增，常在水槽中暴饮，食欲时好时坏；贫血，抓捕时齿龈易出血，可视黏膜苍白，口腔黏膜、齿龈和软腭上出现出血和溃疡；排煤焦样便，多死于尿毒症，进行性消瘦，生长缓慢，营养不良，体重减轻。病程数周、数月不等。个别貂具有神经症状，表现抽搐、痉挛、步态蹒跚，共济失调或后肢麻痹等症状。３．３ 病理变化血液变化主要表现在浆细胞增多和血清丙种球蛋白量增加。丙种球蛋白可从正常貂的１ｇ／１００ｍＬ血清，增至４ｇ／１００ｍＬ～５ｇ／１００ｍＬ。病理剖检变化死貂尸体高度消瘦，多数病例有腹水，表现肝变性或不同程度的肿胀，质地增厚、淤血、呈红褐色，实质内有小坏死灶；肾肿大，充血，表面散在斑点状出血，高低不平，肾小球的基膜模糊不清，出现萎缩；脾和淋巴结显著肿大，呈暗红色；心脏扩张；肺气肿、有出血点；脑膜充血。３．４ 流行病学病貂和隐性感染水貂是本病的传染源，病毒通过粪便、唾液、尿液等途径排除和扩散，通过消化道、呼吸道感染，也可通过胎盘直接传染给后代。本病常年流行，没有年龄、性别的明显区别，成年水貂感染率高于育成水貂，新生仔兽感染率较低，随着月龄逐日增加，该病对母貂危害更大，病貂几乎均以死亡告终。秋、冬交际变冷的季节，感染水貂的发病率和死亡率明显高于其他季节。由于本病在临床上主要是经过缓慢，呈隐性感染较多，临床症状不典型，且易与其他疾病相混淆，根据本病在流行病学、症状和病理变化只能作出初步诊断。进一步确诊须通过实验室检查。１犛犖／犜２８４７—２０１１４ 病原分离鉴定４．１ 仪器、试剂与材料４．１．１ 仪器生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、高速冷冻离心机、组织匀浆器。移液器［移液器（２００μＬ～１０００μＬ、２０μＬ～２００μＬ）、吸管（５ｍＬ、１０ｍＬ）］细胞培养瓶。４．１．２ 材料与试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格。培养液、维持液、胰蛋白酶溶液（配制方法见Ａ．１～Ａ．５）、新生犊牛血清、青霉素、链霉素。４．１．３ 细胞猫肾传代细胞（ＣＲＦＫ）。４．２ 病料采集与处理４．２．１ 组织脏器的采集与处理无菌取病貂的肝、肾、脾、肠细膜淋巴结等组织脏器各２ｇ，按１∶１０的比例用不含犊牛血清的ＤＭＥＭ培养液制成匀浆，反复冻融三次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，取上清液经０．２２μｍ微孔滤膜过滤，加入抗菌素至终浓度为青霉素２００ＩＵ／ｍＬ，链霉素２００μｇ／ｍＬ，冷藏备用。４．２．２ 粪便、尿、血清及全血样品采集与处理４．２．２．１ 取粪便２ｇ，按１∶１０的比例用不含犊牛血清的ＤＭＥＭ培养液制成悬液，然后１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心３０ｍｉｎ，取上清液经０．２２μｍ微孔滤膜过滤，加入抗菌素至终浓度为青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ，链霉素２０００μｇ／ｍＬ，冷藏备用。４．２．２．２ 取尿液样品５ｍＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，取上清液经０．２２μｍ微孔滤膜过滤，加入抗菌素至终浓度为青霉素２０００ＩＵ／ｍＬ，链霉素２０００μｇ／ｍＬ，冷藏备用。４．２．２．３ 无菌采取发病动物全血５ｍＬ，加入柠檬酸钠抗凝剂，冷藏备用。无菌采取全血并分离血清，加入抗菌素至终浓度为青霉素２００ＩＵ／ｍＬ，链霉素２００μｇ／ｍＬ，冷藏备用。４．３ 病料接种当经过ＤＭＥＭ培养液培养的ＣＲＦＫ细胞长成单层时，弃去ＤＭＥＭ培养液，用ＤＭＥＭ培养液冲洗细胞单层，然后将上述处理过的样品接种已经长成单层的ＣＲＦＫ细胞，接种量为培养液量的１０％，３７℃恒温培养箱中吸附１ｈ～２ｈ，倾去多余液体并用无血清ＤＭＥＭ培养液冲洗一次，加入含１０％新生犊牛血清（经过５６℃水浴灭活３０ｍｉｎ，过滤除菌，无支原体）的ＤＭＥＭ培养液，置３２℃的５％二氧化碳恒温培养箱中培养４ｄ～６ｄ，在此期间采用ＤＭＥＭ维持液。同时设正常细胞对照。４．４ 观察结果接种２４ｈ后置显微镜下观察。如果正常细胞对照成立，接种病料的细胞出现细胞变圆、拉网、脱落等细胞病变，收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱中待鉴定。如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，应盲传３代，必要时可增加传代次数。如果盲传过程中出现细胞病变，按上述原则，收获细胞培养物，放入－７０℃冰箱中待鉴定；若盲传２代未出现细胞病变，则按未分离到水貂阿留申病毒出具结果。２犛犖／犜２８４７—２０１１４．５ 病毒鉴定取细胞培养物进行负染，电镜下观察，病毒粒子为２２ｎｍ～２５ｎｍ，呈球形，正二十面体结构。或将细胞培养物进行ＰＣＲ或荧光ＰＣＲ进行鉴定。５ 对流免疫电泳５．１ 仪器、材料与试剂５．１．１ 仪器电泳仪、电泳槽。５．１．２ 材料玻璃板（厚３ｍｍ，１００ｍｍ×９０ｍｍ或１００ｍｍ×４５ｍｍ），直径３ｍｍ打孔器，移液器（２００μＬ～１０００μＬ、２０μＬ～２００μＬ），吸管（５ｍＬ、１０ｍＬ）。５．１．３ 试剂ｐＨ８．５～８．６三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ）巴比妥钠缓冲液（见Ａ．６）、琼脂糖。５．２ 抗原由指定单位提供或将阿留申病毒国际标准毒株Ｕｔａｈ１通过ＣＲＦＫ传代细胞培养，其培养物经过灭活制备而成。５．３ 血清５．３．１ 阴性血清由指定单位提供或采集非感染阿留申病的健康水貂血液分离获得血清。５．３．２ 阳性血清由指定单位提供或用阿留申病毒国际标准毒株的细胞培养物免疫家兔后分离血清制成，或采自已知阿留申病阳性貂血分离而成。５．３．３ 被检血清用塑料毛细管在貂趾尖采血，将管两端烧融封口或者橡皮泥封口，放在２０℃～３０℃环境下静置１ｈ，再放４℃冰箱１８ｈ～２０ｈ，吸出血清加入离心管中，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清液备用。５．４ 电泳板的制备取水平无划痕的玻璃板将其清洗干净后平放在试验台上，用１０ｍＬ吸管吸取已融化并冷却至７０℃左右的０．８％琼脂糖缓冲液，利用张力将缓冲液均匀地铺于玻璃板上，待冷却凝固后备用，现用现配。５．５ 打孔及封底将已凝固的琼脂糖凝胶板放在孔径３ｍｍ、孔距３ｍｍ的打孔模型图纸上，用打孔器进行打孔，然后用针头将孔内的胶轻轻地挑出。参见附录Ｂ。待打孔完毕，将玻璃板置酒精灯外焰上加热，使各孔底部与玻璃板凝固形成封膜，置室温冷却３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ，备用。３犛犖／犜２８４７—２０１１５．６ 加样待检血清按编号顺序用移液器逐份加到靠阳极的血清孔内，以加满不溢出为宜，每份样品更换一个移液器的吸头；将抗原用移液器加在对应的靠阴极的抗原孔内，以加满不溢出为宜。同时每板设阳性和阴性血清对照。５．７ 电泳将电泳槽两侧加满电泳缓冲液，将加样完毕的平板放于电泳槽架上，将抗原孔端置于电泳仪阴极，血清孔端置于阳极，以双层滤纸或纱布进行搭桥，一端放在琼脂糖板的边缘，不要盖住加样孔，一端放入电泳槽内的电泳缓冲液中。接通电源，电压为９０Ｖ～１００Ｖ，３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ结束电泳观察结果。５．８ 结果判定５．８．１ 判定条件电泳结束后，关闭电源，取出玻璃板在阳光下或白灯下以黑色为背景观察沉淀线，判定结果。只有标准阳性血清和抗原孔之间有明显沉淀线，标准阴性血清和抗原孔之间无沉淀线时，判定结果有效，否则无效。若在抗原和血清孔之间出现模糊不清的沉淀线而难以判定时，可用２％氯化钠水溶液浸泡琼脂板１５ｍｉｎ～１８ｍｉｎ，或放４℃冰箱湿盒内次日判定。若次日仍无法判定则应重做。５．８．２ 阳性判定在抗原和血清孔之间稍偏向血清孔一侧形成一条直的或弯曲的十分清晰的灰白色沉淀线即判为阳性。５．８．３ 阴性判定在抗原和血清孔之间无任何沉淀线，或虽在血清孔近旁出现较宽呈云雾状的弧形沉淀带，但其外侧缺乏另一条直的灰白色沉淀线者，判为阴性。６ 聚合酶链（犘犆犚）反应６．１ 设备、材料与试剂６．１．１ 设备ＰＣＲ扩增仪、低温高速离心机、电泳仪、电泳槽、凝胶成像分析系统、冰箱、生物安全柜、组织匀浆器。６．１．２ 材料可调微量移液器（２００μＬ～１０００μＬ、２０μＬ～２００μＬ、２μＬ～２０μＬ、０．５μＬ～１０μＬ），１．５ｍＬ、０．２ｍＬ离心管和吸头（用ＤＥＰＣ水处理后高压灭菌备用，处理方法见Ａ．７）。６．１．３ 试剂所用水均符合分析实验室用水规格。蛋白酶Ｋ、Ｔｒｉｓ饱和酚、酚∶三氯甲烷∶异戊醇（２５∶２４∶１）、无水乙醇、７０％乙醇、ＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍＬ）、ＴＥ（ｐＨ８．０）、犜犪狇ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／μＬ）、ｄＮＴＰｓ（每种浓度均为１０ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＲＮａｓｉｎ（４０Ｕ／μＬ）、氯化镁（１５ｍｍｏｌ／Ｌ）、琼脂糖（电泳级）、ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００、５０×Ｔｒｉｓ冰乙酸（ＴＡＥ）电泳缓冲液、１０ｍｇ／ｍＬ溴化乙锭溶液、１％琼脂糖凝胶（配制方法见附录Ａ）。６．１．４ 阳性对照由指定单位提供或将阿留申病毒国际标准毒株Ｕｔａｈ１通过ＣＲＦＫ传代细胞培养，其培养物经过４犛犖／犜２８４７—２０１１灭活制备而成。６．１．５ 阴性对照由指定单位提供或将生长良好的猫肾传代细胞，冻融２次～３次，５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液备用。６．１．６ 引物根据水貂阿留申病毒（ＡＤＶ）国际标准株Ｕｔａｈ１基因序列，在其保守的ＶＰ２基因序列内设计合成一对特异性引物：５’ＣＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴ３’，５’ＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡＣＣＣ３’，配制成１０ｐｍｏｌ／μＬ。－２０℃保存。６．２ 犇犖犃的提取取４．２中处理样品４００μＬ，或取病毒细胞培养液４００μＬ，－２０℃反复冻融２次～３次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；将上清液转入另一离心管中，加入等体积的消化缓冲液及５μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ）５０℃消化２ｈ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；将上清液转移到一新的离心管中，加入等体积的Ｔｒｉｓ饱和酚，充分振荡混匀，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ；取上层水相转移入一新的离心管中，加入等体积的酚∶三氯甲烷∶异戊醇（２５∶２４∶１）混匀后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ（重复此步骤一次）；取上层水相转移入一新的离心管中，加入２倍体积预冷的无水乙醇，在－２０℃放置１ｈ～２ｈ或室温放置３０ｍｉｎ以沉淀病毒ＤＮＡ；１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清液，用７０％乙醇洗涤沉淀，自然风干；用２０μＬ含ＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍＬ）的ＴＥ（ｐＨ８．０）溶解沉淀，－２０℃保存备用。或按照市售的ＤＮＡ抽提试剂盒操作说明提取病毒ＤＮＡ。６．３ 犘犆犚扩增６．３．１ 犘犆犚反应体系ＰＣＲ反应体系见表１。表１ 犘犆犚反应体系成 分用 量μＬ１０×