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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８５０—２０１１病毒性出血性败血症检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狏犻狉犪犾犺犪犲犿狅狉狉犺犪犵犻犮狊犲狆狋犻犮犪犲犿犻犪（犞犎犛）２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《水生动物病诊断手册２００９版》第２．３．９章中病毒性出血性败血症的方法。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局。本标准主要起草人：高隆英、张利峰、段宏安、史秀杰、徐晔、江育林。Ⅰ犛犖／犜２８５０—２０１１病毒性出血性败血症检疫技术规范１ 范围本标准规定了病毒性出血性败血症病毒（ｖｉｒａｌｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａｖｉｒｕｓ，ＶＨＳＶ）的检测，经细胞分离到病毒后，用间接荧光抗体试验（ＩＦＡＴ）、酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、逆转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）及测序等鉴定的检疫规范。本标准适用于鱼类病毒性出血性败血症的检疫诊断和流行病学调查。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＢＦ２：蓝鳃太阳鱼细胞系ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病变效应ＤＥＰＣ：焦碳酸二乙酯ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核糖核苷三磷酸ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸ＥＰＣ：鲤鱼上皮瘤细胞系ＦＣＳ（ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ）：胎牛血清ＨＥＰＥＳ：犖２羟乙基哌嗪犖’２乙磺酸ＲＴＧ２：虹鳟鱼性腺细胞系ＲＴＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：逆转录聚合酶链式反应犜犪狇酶（犜犪狇ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）：犜犪狇ＤＮＡ聚合酶Ｔｒｉｓ［ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ］：三（羟甲基）氨基甲烷ＶＨＳＶ（ＶｉｒａｌＨａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃＳｅｐｔｉｃａｅｍｉａｖｉｒｕｓ）：病毒性出血性败血症病毒４ 仪器和设备４．１ 超净工作台。４．２ 生化培养箱。４．３ 荧光倒置显微镜。４．４ 冷冻离心机。４．５ －８０℃超低温冰箱。１犛犖／犜２８５０—２０１１４．６ －２０℃普通冰箱。４．７ 磁力搅拌器。４．８ 真空高压过滤器。４．９ ＰＣＲ仪。４．１０ 微量移液器及吸头。４．１１ 电泳仪。４．１２ 凝胶成像仪或紫外透射仪。４．１３ 酶标仪。４．１４ 剪刀、镊子、离心管、ＰＣＲ管和细胞培养器皿等耗材。５ 试剂和材料５．１ 水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格，用于ＲＴＰＣＲ时要用ＤＥＰＣ处理，除去ＲＮＡ酶。５．２ ＶＨＳＶ参考株：由国家质量监督检验检疫总局指定提供。５．３ 抗ＶＨＳＶ的Ｉｇ（包被用）：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。５．４ 抗ＶＨＳＶ的抗血清和包被用Ｉｇ不是来源于同一种动物：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。５．５ ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）：标记的抗抗体：是抗５．４中所指动物的抗体。５．６ 辣根过氧化物酶标记的抗抗体：是抗５．４中所指动物抗体。５．７ 细胞生长液：含１０％胎牛血清的１９９细胞培养液（含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的１９９培养基配制）（配制见附录Ａ）。５．８ 细胞维持液：含２％胎牛血清的１９９细胞培养液（含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的１９９培养基配制）。５．９ 无水乙醇，分析纯，使用前预冷到－２０℃。５．１０ 反转录酶ＡＭＶ：－２０℃保存，避免温度剧烈变化。５．１１ ＲＮＡ酶抑制剂：－２０℃保存，避免温度剧烈变化。５．１２ 犜犪狇酶：－２０℃保存，避免温度剧烈变化。５．１３ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００。５．１４ 琼脂糖。５．１５ 引物：正向引物Ｆ：５’ＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧ３’反向引物Ｒ：５’ＧＣＧＧＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣ３’该引物可以扩增ＶＨＳ病毒目前已知的４个基因型所有毒株的Ｎ基因的５０５个碱基片段（序列参见附录Ｂ）。５．１６ 丙酮：分析纯。５．１７ ０．０５％吐温８０。５．１８ ｐＨ８．５甘油生理盐水。５．１９ ５％脱脂奶。６ 采样对有临床症状的鱼（参见附录Ｃ），如果是体长＜４ｃｍ的鱼苗取整条鱼，４ｃｍ≤体长≤６ｃｍ的鱼苗取内脏（包括肾）；体长＞６ｃｍ的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼的采样数量按ＧＢ１８０８８的规定采样。同样要取肾、脾和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。２犛犖／犜２８５０—２０１１７ 操作步骤７．１ 细胞培养分离犞犎犛犞７．１．１ 采用的细胞系ＢＦ２、ＲＴＧ２、ＥＰＣ。ＢＦ２细胞系对淡水分离到的ＶＨＳＶ是高度敏感的。建议同时采用包括ＢＦ２在内的两种细胞来培养分离病毒。７．１．２ 样品处理将样品置研钵中加入石英砂研磨，随后按１∶１０的比例将研磨好的组织样悬浮于含有１０００ＩＵ／ｍＬ青霉素和１０００μｇ／ｍＬ链霉素的培养液中，于２５℃下悬浮２ｈ～４ｈ或４℃下孵育过夜。５０００犵离心１５ｍｉｎ，收集上清液。７．１．３ 接种细胞单层把已按１∶１０制备的组织匀浆上清液再作二次１０倍稀释（用生长液或维持液稀释均可），即达到１∶１００和１∶１０００组织上清稀释液，接种到生长２４ｈ内的长满细胞单层的９６孔板。每个样品至少接种２孔，每孔加０．１ｍＬ。试验中要有２孔阳性对照（接种ＶＨＳＶ参考株）和２孔空白对照（未接种病毒的细胞）。后置于１５℃～１８℃培养。每天用显微镜观察ＣＰＥ，连续观察７ｄ。如果在７ｄ内没有ＣＰＥ出现，则还要用敏感细胞再盲传一次。传代程序如下：将接种上述组织上清液的细胞培养物７ｄ后冻融收集，５０００犵，４℃离心１５ｍｉｎ，离心后取上清并作１∶１０和１∶１００稀释，接种到同种的长满单层的新鲜细胞中，再培养观察７ｄ。接种了被检匀浆上清稀释液的细胞板或者盲传后的细胞板中出现ＣＰＥ，应立即取病毒悬液用下述方法进行鉴定。如果仅有阳性对照出现ＣＰＥ，样品经过接种细胞和盲传后均没有ＣＰＥ出现，则结果判为阴性。如果阳性对照也未出现ＣＰＥ，则应换用新一批敏感细胞重新进行细胞分离培养。７．２ 病毒鉴定７．２．１ 间接荧光抗体试验７．２．１．１ 在２ｃｍ２的塑料细胞培养板孔中或盖玻片上制备细胞单层，通常在２２℃孵育２４ｈ即可达到８０％长满单层细胞。７．２．１．２ 当准备好用作感染的细胞单层后，在传入细胞的当天或第２天，直接将１０倍稀释的待鉴定的病毒悬液接种到细胞培养孔。每个待鉴定的病毒分离物接种６孔。７．２．１．３ 按７．２．１．２同样方法稀释并接种ＶＨＳＶ的２孔作阳性对照，其细胞培养液中病毒滴度要达到５０００ＰＦＵ／ｍＬ～１００００ＰＦＵ／ｍＬ。另２孔只加细胞培养液为阴性对照７．２．１．４ 在１５℃培养２４ｈ。７．２．１．５ 孵育结束后，吸出细胞培养液，用０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳ漂洗１次，然后用冷的固定液（见附录Ａ）快速漂洗３次。７．２．１．６ 每２ｃｍ２细胞单层用０．５ｍＬ固定液固定１５ｍｉｎ。７．２．１．７ 使细胞单层在空气中干燥至少３０ｍｉｎ，立即继续下步实验或置于－２０℃保存。７．２．１．８ 用ＰＢＳＴ（见附录Ａ）清洗４次。７．２．１．９ 用含０．０５％吐温８０，０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．２的ＰＢＳＴ把抗ＶＨＳＶ的抗血清按说明书稀释到工３犛犖／犜２８５０—２０１１作浓度。７．２．１．１０ 加入抗血清溶液，每２ｃｍ２孔加０．２５ｍＬ。将加入抗血清的细胞单层在３７℃湿盒内反应１ｈ。７．２．１．１１ 用上述ＰＢＳＴ缓冲液洗４次。７．２．１．１２ 用ＦＩＴＣ标记的抗抗体稀释到工作浓度，每２ｃｍ２孔加０．２５ｍＬ。在３７℃下反应１ｈ。该抗抗体应是对应抗前面所用抗ＶＨＳＶ免疫球蛋白的。７．２．１．１３ 用ＰＢＳＴ缓冲液漂洗４次。７．２．１．１４ 立即观察在塑料板上的处理过的细胞单层，盖玻片要用９０％，ｐＨ８．５的甘油生理盐水封片，显微镜观察。７．２．１．１５ 用１０倍目镜和较大孔径的２０倍～４０倍物镜，在荧光显微镜下观察。应在阳性和阴性样品中看得到预期的结果后才能进行其他样品的观察。阳性反应通常在细胞层上有特异的黄绿色荧光点，阴性样品只有微弱的绿色背景。７．２．２ 酶联免疫吸附试验７．２．２．１ 用包被稀释液（见附录Ａ）将纯化的抗ＶＨＳＶ的免疫球蛋白（Ｉｇ）稀释到工作浓度，每孔加０．２ｍＬ。包被ＥＬＩＳＡ微量板。在４℃孵育过夜或者３７℃反应１．５ｈ～２ｈ。７．２．２．２ 用含０．０５％吐温２０的０．０１ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳＴ冲洗４次。７．２．２．３ 用５％脱脂奶（２００μＬ／孔）封闭，３７℃孵育１ｈ。７．２．２．４ 用上述ＰＢＳＴ冲洗４次。７．２．２．５ 加２％的无离子洗涤剂（ＴｒｉｔｏｎＸ１００或ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０）到待检的病毒悬液中做２倍或４倍系列稀释。７．２．２．６ 每孔加入１００μＬ经２倍或４倍系列稀释的待检病毒，每个样品２孔。另将已知标准ＶＨＳ病毒（阳性对照）、正常组织样品（阴性对照）和细胞培养液（空白对照）也各加２孔。于３７℃下和包被好的抗ＶＨＳＶ抗体反应１ｈ。７．２．２．７ 用上述ＰＢＳＴ洗４次。７．２．２．８ 每孔加０．１ｍＬ用细胞培养液稀释到工作浓度的抗ＶＨＳ病毒血清。该抗血清不能和包被用的抗体来源于相同的的动物。３７℃孵育１ｈ。７．２．２．９ 用上述ＰＢＳＴ洗４次。７．２．２．１０ 每孔加０．１ｍＬ０．１％的Ｈ２Ｏ２（用双蒸水稀释）。３７℃反应１５ｍｉｎ以除掉非特异性的过氧化物酶。倒出孔内液体，用ＰＢＳＴ洗２次。７．２．２．１１ 每孔加入０．１ｍＬ用细胞培养液稀释到工作浓度的辣根过氧化物酶标抗抗体。该抗抗体应是对应抗７．２．２．８所用的抗体。３７℃反应１．５ｈ～２ｈ。７．２．２．１２ 用ＰＢＳＴ冲洗４次。加入底物ＯＰＤ溶液（见Ａ．１２）（也可以用其他底物和显色剂，如：ＴＭＢ四甲基联苯胺，及相应的检测条件）。当阳性对照出现明显棕黄色，阴性对照无色时，立即每孔加入０．２ｍＬ浓度为２ｍｏｌ／Ｌ的硫酸终止反应，尽快用酶标仪测量各孔在波长＝４９０ｎｍ时的光吸收值（ＯＤ值）。７．２．２．１３ 结果判定：以样品孔的ＯＤ值（Ｐ）与阴性对照的ＯＤ值（Ｎ）之比不小于２．１（即Ｐ／Ｎ≥２．１）定为阳性。７．２．３ 逆转录聚合酶链反应７．２．３．１ 犚犖犃抽提将待检的病毒悬液４５０μＬ加入１．５ｍＬ的离心管中，然后加入４５０μＬＣＴＡＢ溶液（见Ａ．１）用旋４犛犖／犜２８５０—２０１１涡振荡器将其混匀，２５℃作用２．５ｈ。加入６００μＬ抽提液Ⅱ（酚／三氯甲烷／异戊醇）（见附录Ａ），充分混合不少于３０ｓ。１４０００犵离心５ｍｉｎ，取上层水相（约８００μＬ）。再加入７００μＬ抽提液Ⅰ（三氯甲烷／异戊醇）（见附录Ａ），充分混合不少于３０ｓ。１４０００犵离心５ｍｉｎ，取上层水相（约６００μＬ）。再加入－２０℃预冷的１．５倍体积的无水乙醇（约９００μＬ），充分混匀后，－２０℃８ｈ以上沉淀核酸。１４０００犵离心３０ｍｉｎ，小心弃去上清液，放入干燥箱干燥，干燥后加入１１μＬ经ＤＥＰＣ处理过的水，溶解后作为ＲＴＰＣＲ模板溶液。７．２．３．２ 变性和退火在ＰＣＲ管中加入１０μＬ模板溶液和２．５μＬ引物ＶＨＳＶＲ，加２．５μＬ水使总体积为１５μＬ。置于７０℃反应５ｍｉｎ。立即冰浴。７．２．３．３ 犮犇犖犃合成在７．２．３．２反应管中继续加入：５μＬ的５倍逆转录酶浓缩缓冲液（见附录Ａ）、２μ