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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１０８７—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２犙热检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犙犳犲狏犲狉２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２《牛Ｑ热微量补体结合试验操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２相比，主要技术变化如下：———增加了病原分离和鉴定；———增加了间接免疫荧光试验和酶联免疫吸附试验方法。本标准同等采用世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ》（２００８版）中第２．１．１２章Ｑ热部分。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：鄢志强、柯忠哲、马保华、鱼海琼、林志雄、李贺、林宝珍、陈升毅、吕平、刘计亮、朱来华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１０８７—２００２。Ⅰ犛犖／犜１０８７—２０１１犙热检疫技术规范１ 范围本标准规定了Ｑ热的检疫规范，包括病原分离鉴定、血清学试验，其中血清学试验包括酶联免疫吸附试验、间接免疫荧光试验和补体结合试验。本标准适用于进出境牛、羊等易感动物Ｑ热的检疫和诊断。２ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＱＦｅｖｅｒ：Ｑ热Ｃ．Ｂｕｒｎｅｔｉｉ：伯纳特柯克斯体ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验ＩＦＡ：间接免疫荧光试验ＨＥＬ：人胚肺成纤维细胞ＣＰＥ：细胞致病效应ＰＢＳ：磷酸盐缓冲液ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光素ＲＮＡ：核糖核酸ＯＰＤ：邻苯二胺ＯＤ值：光密度值ＶＢＤ：巴比妥钙镁缓冲液ＬＰＳ：脂多糖３ 临床症状Ｑ热临床症状及其他信息参见附录Ａ。４ 检疫方法４．１ 病原分离和鉴定４．１．１ 材料准备４．１．１．１ 器材：荧光显微镜、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、２５ｃｍ２细胞培养瓶、２４孔平底细胞培养板、带盖湿盒、组织捣碎机、冷冻离心机。４．１．１．２ 试剂：４．１．１．２．１ 无犆．犅狌狉狀犲狋犻犻抗体犊牛血清。４．１．１．２．２ 人胚肺成纤维细胞（ＨＥＬ）。１犛犖／犜１０８７—２０１１４．１．１．２．３ 犆．犅狌狉狀犲狋犻犻标准菌株和标准阳性、阴性血清、犆．犅狌狉狀犲狋犻犻荧光抗体。４．１．１．２．４ 溶液及细胞培养液：见附录Ｂ。４．１．１．３ １日龄～２日龄豚鼠。４．１．１．４ 链霉素、庆大霉素。４．１．１．５ 样品：胎盘子叶、肺、肝、流产胎儿皱胃内容物；母畜阴道分泌物、奶样、粪便。４．１．２ 样品的处理将样品剪碎，在组织捣碎机内捣碎，用含抗生素（链霉素１００μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ和庆大霉素５０μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬ）的ＰＢＳ磷酸盐缓冲液制成组织悬液，于４℃作用４ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ离心后，保留上清液。４．１．３ 病原分离对无污染的样品，按常规方法培养ＨＥＬ单层细胞，倒去培养液，接种样品组织上清液，每样接种３瓶，每瓶接种１ｍＬ。于３７℃吸附２ｈ后加细胞维持液，封闭、置３７℃二氧化碳箱培养，２４ｈ后逐日在倒置显微镜下观察细胞病变，连续观察２１ｄ犆．犅狌狉狀犲狋犻犻特征性ＣＰＥ（细胞致病效应）：ＨＥＬ细胞空泡化。无ＣＰＥ的盲传２代。如有ＣＰＥ，则待７０％细胞出现ＣＰＥ时收毒，将细胞反复冻融２次，３０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，取上清液４℃保存待鉴定。４．１．４ 培养物的鉴定４．１．４．１ 将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成２×１０５／ｍＬ的细胞悬液，加入到２４孔细胞培养板内，每孔３ｍＬ，封闭、置３７℃二氧化碳培养箱培养。４．１．４．２ 等细胞生长成８０％的单层，吸出孔内培养液，接种４．１．３待鉴定上清液，每孔３ｍＬ，每个样品２个孔；另外４．１．３上清液用适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阳性血清中和后接种２个孔，每孔３ｍＬ；阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物，每个对照２个孔。４．１．４．３ 置３７℃二氧化碳培养箱吸附２ｈ。４．１．４．４ 吸出各孔内所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔３ｍＬ，封闭、置３７℃二氧化碳培养箱培养１０ｄ。４．１．４．５ 取出细胞板，ＰＢＳ漂洗，自然干燥后，用－２０℃预冷的丙酮固定３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗３次，每次５ｍｉｎ，自然干燥。４．１．４．６ 滴加适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阳性血清，置３７℃作用１ｈ。４．１．４．７ 滴加适量犆．犅狌狉狀犲狋犻犻免疫荧光抗体（二抗），放进湿盒，３７℃作用２ｈ。４．１．４．８ 用ＰＢＳ洗３次，倾去液体。４．１．４．９ 荧光显微镜镜检。４．１．５ 结果判定阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内。阴性对照、空白对照无荧光。没有经过阳性抗体作用的细胞荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性。没有经过阳性抗体作用的细胞荧光微弱，形态不清晰，经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则重检；重检后仍荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性。２犛犖／犜１０８７—２０１１如果阳性对照无特异性荧光或阴性对照出现特异性荧光，则试验失败，应该重检。４．２ 间接免疫荧光试验（犐犉犃）４．２．１ 材料准备４．２．１．１ 器材荧光显微镜、保湿培养箱、冲洗盆、微量移液器等。４．２．１．２ 试剂４．２．１．２．１ ＩＦＡ抗原平板诊断板的制备：见附录Ｂ。４．２．１．２．２ ＦＩＴＣ标记的兔抗牛（羊）ＩｇＧ：使用时用含０．０１％伊文思蓝的样品稀释液稀释至工作浓度。４．２．１．２．３ ＰＢＳ、甘油缓冲液、１％伊文思蓝染色液、犆．犅狌狉狀犲狋犻犻阴性和阳性对照血清。４．２．１．３ 样品采集待检动物血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌的２ｍＬ离心管内，４℃或－２０℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。４．２．２ 操作方法４．２．２．１ 待检血清灭能３０ｍｉｎ（牛：５６℃～５７℃；绵羊、山羊：６３℃），然后用ＰＢＳ作１／４０～１／６４０倍比稀释。４．２．２．２ 取出事先准备好的抗原诊断板，置室温预温，不要触摸板孔。４．２．２．３ 每孔滴加２０μＬ稀释度不同的血清，同时做阴性和阳性血清对照，其中一孔，滴加２０μＬＰＢＳ作为抗原对照。４．２．２．４ 置保湿培养箱３７℃３０ｍｉｎ。反应板用ＰＢＳ冲洗两次，每次１０ｍｉｎ。用ＰＢＳ洗涤，风干。４．２．２．５ 每孔（包括对照孔）滴加工作浓度的ＦＩＴＣ标记的兔抗牛（羊）ＩｇＧ２０μＬ，于３７℃保湿培养箱中孵育３０ｍｉｎ。用ＰＢＳ洗涤三次，风干后立即用荧光显微镜观察。４．２．３ 结果判定阳性血清对照孔出现规则形状的特异性强绿色荧光信号，阴性血清对照孔及抗原对照孔无特异性绿色荧光信号，则试验成立，可进行结果判定。待检血清在１／１６０及更高稀释时，有形状规则的特异性绿色荧光信号时，可判定为阳性。待检血清在１／１６０及更高稀释时，没有形状规则的特异性绿色荧光信号时，可判定为阴性。４．３ 酶联免疫吸附试验（犈犔犐犛犃）４．３．１ 材料准备４．３．１．１ 器材酶标仪、微量酶标反应板、３７℃培养箱、保湿盒、冰箱、８道或１２道微量移液器、微量板振荡器、洗板机等。４．３．１．２ 试剂犆．犅狌狉狀犲狋犻犻全细胞灭活抗原、酶标结合物、十倍浓度的稀释液（吐温／ＰＢＳ液）、洗涤液、封闭液、双３犛犖／犜１０８７—２０１１蒸水、四甲基联苯胺（ＴＭＢ）、双氧水、终止液、阳性及阴性对照血清。４．３．１．３ 样品采集待检动物血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌２ｍＬ离心管，４℃或－２０℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。４．３．２ 操作方法４．３．２．１ 包被抗原：取９６孔平底微量反应板，于各孔加工作浓度的全细胞灭活抗原１００μＬ，封板，置保湿盒内放３７℃培养箱中感作６０ｍｉｎ，再放置４℃冰箱内过夜。４．３．２．２ 洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔３００μＬ，洗涤三次，每次１ｍｉｎ，在吸水纸上轻拍干。４．３．２．３ 封闭：每孔加入封闭液１００μＬ，封板后置室温感作３０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ。４．３．２．４ 洗板：方法同４．３．２．２。４．３．２．５ 将血清样品包括对照血清稀释至适当浓度（通常为１／１００），每孔滴加１００μＬ，每个样品加２个孔。对照血清包括阴性、阳性血清。４．３．２．６ 盖上微量板，置室温感作３０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ。４．３．２．７ 洗板：方法同４．３．２．２。４．３．２．８ 将酶标结合物稀释至工作浓度，每孔滴加１００μＬ。４．３．２．９ 盖上微量板，置室温感作３０ｍｉｎ～９０ｍｉｎ。４．３．２．１０ 洗板：方法同４．３．２．２。４．３．２．１１ 每孔加１００μＬＴＭＢ底物溶液，根据产品说明，感作说明书上规定的时间。４．３．２．１２ 加终止液１００μＬ终止氧化物酶反应。４．３．２．１３ 用酶标仪在波长４５０ｎｍ下测定ＯＤ值，这些ＯＤ值将用于计算结果。４．３．３ 结果判定对于商用试剂盒，可根据其提供的值和解释判定。一般情况下，计算待测血清以及阳性和阴性对照血清的平均吸光值［待检血清平均ＯＤ值（Ａｂ）、阳性血清平均ＯＤ值（Ａｂｐｏｓ）和阴性血清平均ＯＤ值（Ａｂｎｅｇ）］。按式（１）计算每份血清的百分比犘（％）：犘＝（Ａｂ－Ａｂｎｅｇ）／（Ａｂｐｏｓ－Ａｂｎｅｇ）×１００％…………………………（１） 结果判定如下：犘＜３０％：判为阴性血清。犘在３０％～４０％之间：判为可疑血清，对于可疑血清，需要重新检验，如重新检验结果仍为３０％～４０％之间，则判定为阳性血清。犘＞４０％：判为阳性血清。４．４ 补体结合试验（犆犉）４．４．１ 材料准备４．４．１．１ 器材９６孔Ｕ型底反应板、微量板振荡器、３７℃培养箱、水浴锅、８道或１２道微量移液器、离心机。４．４．１．２ 试剂ｐＨ７．２巴比妥钙镁缓冲液（ＶＢＤ）、绵羊红细胞、溶血素、犆．犅狌狉狀犲狋犻犻抗原、补体、阳性和阴性对照４犛犖／犜１０８７—２０１１血清。４．４．１．３ 样品采集待检动物血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，４℃或－２０℃冰箱保存或立即送检，试验前将待检血清统一编号。４．４．２ 预备试验４．４．２．１ 溶血素效价的测定４．４．２．１．１ 溶血素的稀释：取溶血素０．１ｍＬ加ＶＢＤ９．９ｍＬ混匀（如果是等量甘油保存的溶液，取溶血素０．２ｍＬ加ＶＢＤ９．８ｍＬ），制成１００倍稀释的溶血素，再用ＶＢＤ把已经１００倍稀释的溶血素分别稀释成５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００倍稀释的９种溶液。４．４．２．１．２ 补体的稀释：用ＶＢＤ把补体分别稀释成３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍稀释的８种溶液。４．４．２．１．３ 致敏红细胞悬液的制备：将不同稀释度（１∶５００～１∶６０００）的溶血素与等量的２％红细胞悬液混合，置３７℃水浴１５ｍｉｎ，作为致敏红细胞。４．４．２．１．４ 溶血素效价的滴定：采用方阵法在微量板上滴定。如表１所示，１～９列为溶血素稀释度（１∶５００～１∶６０００），ＡＨ行为补体稀释度（１∶３０～１∶１００）。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液５０μＬ，分别滴加于１～９列的各孔中。吸取不同稀释度的补体５０μＬ，分别滴于ＡＨ行各孔中，每孔再加２５μＬＶＢＤ，滴加完毕后，置微量振荡器上混匀，随后置３７℃温箱中感作３０ｍｉｎ后进行初判，置室温２ｈ、水平转子离心机２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ或置４℃冰箱中过夜后进行终判。表１ 溶血素效价滴定判定举例表补体稀释比例溶血素稀释比例１∶５００１∶１０００１∶１５００１∶２０００１∶２５００１∶３０００１∶４０００１∶５０００１∶６０００１∶３０－－－－－－－＋＋１∶４０－－－－－－－＋＋１∶５０－－－－－－－＋＋１∶６０－－－－－－－＋＋１∶７０