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牛Q热微量补体结合试验操作规程ProcedureofmicrocomplementfixationtestforbovineQfeverSN/T1087—2002前 言 本标准按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》的要求，对原《中华人民共和国进出境动物检疫规程手册》(1997年12月)中的“牛Q热微量补体结合试验”进行修订。 本标准的附录A是标准的附录。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、广州出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：柯忠哲、朱世强、林志雄、张立怀、范华炜。 本标准系首次发表的检验检疫行业标准。1范围 本标准规定了牛Q热微量补体结合试验的操作技术要求。 本标准适用于牛、羊Q热微量补体结合试验抗体的检测，其他哺乳动物可以参照本标准。2引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 GB/T6682—1992分析实验室用水规格和试验方法3器材及试剂3.1器材3.1.1微量板：U型底96孔板。3.1.2加样器：8道5μL～50μL可调式移液器，10μL～750μL可调式移液器。3.1.3各种规格塑料滴头、刻度玻璃吸管、试管、试管架。3.1.4离心机：低速，使用水平转子。3.1.5 水浴锅：可调节温度。3.2试剂3.2.1抗原：按说明保存和使用。3.2.2标准抗原：按说明保存和使用。3.2.3标准阳性血清：按说明保存和使用。3.2.4标准阴性血清：按说明保存和使用。3.2.5被检血清：从被检动物静脉采血，分离血清，4℃保存。3.2.6补体：按说明保存和使用。3.2.7溶血素：按说明保存和使用。3.2.8试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。4预备试验4.12%绵羊红细胞悬液：采成年绵羊血，一份血加1.2倍量的阿氏液，混匀，4℃保存，5d后备用。使用前摇匀，取出10mL，用离心机以2000r/min离心5min，弃去上清液，将下沉的红细胞泥用20倍量巴比妥缓冲液(VBD)洗涤，以2000r/min离心5min，重复洗涤三次，最后一次离心10min。取下沉的红细胞泥用VBD配制成2%(V/V)悬液。4.2溶血素效价的测定4.2.1溶血素的稀释：取溶血素0.1mL加VBD9.9mL混匀(如果是等量甘油保存的溶液，取溶血素0.2mL加VBD9.8mL)，制成100倍稀释的溶血素，再按表1稀释成不同倍数。表1溶血素的稀释表4.2.2补体的稀释：按表2对补体做不同倍数的稀释。表2补体的稀释表4.2.3致敏红细胞悬液的制备：将不同稀释度(1∶500～1∶6000)的溶血素与等量的2%红细胞悬液混合，置37℃水浴15min，为致敏红细胞。4.2.4溶血素效价的滴定：采用方阵法在微量板上滴定。如表3所示，1～9列为溶血素稀释度(1∶500～1∶6000)，A～H行为补体稀释度(1∶30～1∶100)。吸取不同稀释度的致敏红细胞悬液50μL，分别滴加于1～9列的各孔中。吸取不同稀释度的补体50μL，分别滴于A～H行各孔中，每孔再加25μLVBD，滴加完毕后，置微量振荡器上混匀，随后置37℃温箱中感作30min后进行初判，置室温2h、水平转子离心机2000r/min离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判。4.2.5溶血素效价的判读：对比标准溶血孔(见附录A)进行，在最小量的补体存在下，能使90%红细胞发生溶血的最高稀释倍数为一个单位溶血素，测定补体效价和做本试验时用两个单位溶血素。如表3的测定结果为，补体在1∶70稀释时，发生90%溶血的最少溶血素为1∶4000，该1∶4000为一个单位溶血素。两个单位溶血素为1∶2000。表3溶血素效价滴定判定举例表注：++为50%溶血；+为75%溶血；-为100%溶血4.3补体效价的测定：4.3.1按照表2配制1∶30～1∶100的补体；4.3.2使用两个单位溶血素，制备致敏红细胞悬液；4.3.3按照表4在微量板上滴定补体效价。1～8列为1∶30～1∶100稀释的补体，各稀释度按表中定量添加，再以VBD补充至每孔50μL；每孔滴加25μL的抗原后，再滴加50μL2%致敏红细胞悬液，充分振荡混匀后，置37℃温箱中感作30min后进行初判，然后置室温2h、水平转子离心机2000r/min离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判。4.3.4补体效价的判读：对比标准溶血孔(见附录A)进行，取30μL补体呈现90%溶血，20μL补体呈现75%～90%溶血时补体的最高稀释度作为补体的效价。在正式试验时补体用量为25μL，如表5的测定结果，1∶70的补体25μL为一个单位补体，试验时123456789500100015002000250030004000500060001∶100溶血素/mL0.20.10.10.10.10.10.10.10.1VBD/mL0.80.91.41.92.42.93.94.95.9总量/mL1.01.01.52.02.53.04.05.06.01234567892030405060708090100补体/mL0.10.050.050.050.050.050.050.050.05VBD/mL1.91.451.952.452.953.453.954.454.95总量/mL2.01.52.02.53.03.54.04.55.0 1234567891∶5001∶10001∶15001∶20001∶25001∶30001∶40001∶50001∶60001∶30———————++1∶40———————++1∶50———————++1∶60———————++1∶70——————90%+++1∶80——————++++1∶90———++++++++1∶100———+++++++++μμ用两个单位补体，则1∶35补体25μL为两个单位补体。表4补体效价滴定表5补体效价判定举例表4.4抗原效价的确认或测定：根据供应单位的抗原说明书来决定是否需要进行抗原效价的测定。如不需测定，则在确认抗原效价后按说明稀释使用；如需测定，则按下列步骤进行。4.4.1用VBD将抗原依次作1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀释。4.4.2用VBD将阳性血清依次作1∶20、1∶40、1∶80稀释。4.4.3标准阴性血清不作稀释。4.4.4按表6建立试验。4.4.5按原效价的判读：对比标准溶血孔(见附录A)进行，当血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔出现100%溶血，而红细胞对照孔不出现溶血且红细胞全部沉于孔底时判定抗原效价。以与阳性血清各稀释度发生完全抑制溶血的最高稀释度为一个单位抗原，正式试验使用2单位抗原，如表7所示，抗原效价为1∶200，正式试验时用2单位抗原，即将抗原作1∶100稀释。表6抗原测定表表7抗原效价判读举例表列号12345678补体稀释度1∶301∶401∶501∶601∶701∶801∶901∶100A/μL5050505050505050B/μL4040404040404040C/μL3030303030303030D/μL2020202020202020E/μL1010101010101010F/μL00000000G/μL H/μL 列号12345678补体稀释度1∶301∶401∶501∶601∶701∶801∶901∶10050——————++40——————+++30————90%+++++20————++++++++10——+++++++++++++++++0++++++++++++++++++++++++++++++++ 注：++++为0%溶血；+++为25%溶血；++为50%溶血；+为75%溶血；-为100%溶血。1234血清对照抗原对照补体对照红细胞对照1∶501∶1001∶2001∶400抗原/μL2525252502500阳性血清1∶10/μL2525252525000阳性血清1∶20/μL2525252525000阳性血清1∶40/μL2525252525000阳性血清1∶80/μL25252525250001∶10阴性血清/μL25252525250002单位补体/μL2525252525000VBD/μL000002550754℃感作12h～18h后再置室温10min致敏红细胞/μL505050505050505037℃感作30min后进行初判，然后置室温2h、水平转子离心机2000r/min离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判5正式试验5.1标准阳性血清和标准阴性血清使用前用VBD作1∶10稀释，56℃水浴灭能30min；被检血清使用前用VBD作1∶10稀释，灭能30min(牛：56℃～57℃；绵羊、山羊：63℃)。按表8建立正式试验。表8补体结合试验正式试验操作表5.2判定5.2.1先观察对照管结果。当阳性血清孔和红细胞对照孔出现100%抑制溶血，阴性血清对照孔、抗原对照孔、补体对照孔及被检血清对照孔均出现100%溶血时判定被检血清结果。5.2.2对比标准溶血孔(见附录A)对被检血清管进行判定，并作如下记录：++++表示90%以上抑制溶血；+++表示75%以上抑制溶血；++表示50%以上抑制溶血；＋表示25%以上抑制溶血；-表示100%溶血。5.2.3判定标准：被检血清1∶10稀释时小于50%抑制溶血为阴性。在进出境动物的检疫中，对判定标准有规定的按规定执行。附录A(标准的附录)标准溶血孔配制A1血红蛋白溶液的制备：取2%绵羊红细胞悬液1.0mL，加入装有7.0mL蒸馏水的试管内，充分振荡，使红细胞全部裂解，再加入2.0mLVBD，充分混合；A20.2%绵羊红细胞悬液的制备：取2%绵羊红细胞悬液1.0mL，加入VBD9.0mL；A3按表A1配制不同溶血度的标准溶血管，并充分振荡均匀。表A1标准溶血管配制表1∶501∶1001∶2001∶400血清对照抗原对照补体对照红细胞对照1∶10++++++++++++++++———++++1∶20++++++++++++++++———++++1∶40++++++++++++++———++++1∶80++++++++++++++———++++1∶10阴性血清———————++++注：++++为0%溶血；+++为25%溶血；+++为50%溶血；+为75%溶血；-为100%溶血被检血清阳性血清阴性血清抗原对照补体对照红细胞对照试验管对照管1∶10被检血清/μL2525000001∶10阳性血清/μL002500001∶10阴性血清/μL002500002单位抗原/μL25 2525252502单位补体/μL2525252525250VBD/μL025002550754℃感作12h～18h后再置室温10min致敏红细胞/μL5050505050505037℃感作30min后进行初判，然后置室温2h、水平转子离心机2000r/min离心5min或置4℃冰箱中过夜后进行终判0102030405060708090100A4从标准溶血管配制表的各管中，分别取125μL加入微量板的对应孔，轻摇混匀后静置，待红细胞全部沉淀于孔底后用于试验判读的对照。血红蛋白溶液/mL00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.00.2%绵羊红细胞悬液/mL1.00.90.80.70.60.50.40.30.20.10