搜索
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１３１６—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３牛海绵状脑病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犫狅狏犻狀犲狊狆狅狀犵犻犳狅狉犿犲狀犮犲狆犺犪犾狅狆犪狋犺狔２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准牛海绵状脑病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１３１６—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张２ 字数５７千字２０１１年１１月第一版 ２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２５８８ 定价３０．００元书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３《牛海绵状脑病病理组织学检查方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３相比，主要的技术性变化如下：———增加了牛海绵状脑病的采样；———增加了蛋白免疫印迹方法；———增加了酶联免疫吸附试验方法（ＥＬＩＳＡ）；———增加了免疫层析试纸条检测方法。本标准参考了国际动物卫生组织（ＯＩＥ）的《诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）《ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ》）中第２．４．６章“牛海绵状脑病的诊断技术”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局起草。本标准主要起草人：马贵平、李炎鑫、李冰玲、刘全国、史喜菊、刘旭辉。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１３１６—２００３。Ⅰ犛犖／犜１３１６—２０１１牛海绵状脑病检疫技术规范１ 范围本标准规定了牛海绵状脑病的采样、组织病理学检查方法、免疫组织化学方法、蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法、免疫层析试纸条检测方法等检测方法的技术要求和操作规范。其中组织病理学检查方法为免疫组织化学方法的辅助方法，免疫组织化学方法和ＳＡＦ蛋白免疫印迹诊断为确诊方法，蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法和免疫层析试纸条检测方法为筛选方法。本标准适用于牛海绵状脑病的诊断，也可用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求３ 临床诊断３．１ 牛海绵状脑病（ＢＳＥ）平均潜伏期为４年～５年。病牛临床表现为精神异常、运动障碍和感觉障碍。３．２ 精神异常：主要表现为不安、恐惧、狂暴等，当有人靠近或追逼时往往出现攻击性行为。３．３ 运动障碍：主要表现为共济失调、颤抖或倒下。病牛步态呈“鹅步”状，四肢伸展过度，后肢运动失调、震颤和跌倒、麻痹、轻瘫；有时倒地难以站立。３．４ 感觉障碍：最常见的是对触摸、声音和光过度敏感，这是ＢＳＥ病牛很重要的临床诊断特征。用手触摸或用钝器触压牛的颈部肋部，病牛会异常紧张颤抖，用扫帚轻碰后蹄，也会出现紧张的踢腿反应；病牛听到敲击金属器械的声音，会出现震惊和颤抖反应；病牛在黑暗环境中，对突然打开的灯光，出现惊吓和颤抖反应。４ 实验室诊断４．１ 采样及样品准备方法４．１．１ 材料４．１．１．１ 被检组织待检牛脑。４．１．１．２ 试剂１０％中性福尔马林溶液（见附录Ａ）；消毒液：２％次氯酸钠，２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠；９８％～９９％甲酸；无水乙醇；９５％乙醇溶液；７０％乙醇溶液；二甲苯；石蜡（熔点为５４℃～５６℃，５６℃～５８℃，５８℃～６０℃）。１犛犖／犜１３１６—２０１１４．１．１．３ 仪器设备脱水包埋盒、镊子、吸水纸、ｐＨ计、手术刀、专用取样勺、刀板、剪刀、锯、载玻片（多聚赖氨酸或其他等效物质处理过）、自动脱水浸蜡机、包埋机、冰箱、切片机、展片槽、烘干台、天平、温箱（３７℃）、ｐＨ计、计时器、安全设施、ＢⅡ生物安全柜、通风橱、一次性腈手套、防护服、防护面罩或口罩、防护眼镜、防切割手套、鞋套、尖锐废弃物容纳盒、灭菌锅（１２１℃）、蒸汽灭菌器（温度不低于１３５℃，且蒸汽不外排）。４．１．２ 方法４．１．２．１ 牛脑组织的采集４．１．２．１．１ 疑似患有ＢＳＥ的病牛在必要的情况下可以先注射镇静剂，再用浓缩巴比妥盐溶液静脉注射处死。４．１．２．１．２ 将头部与躯体从枕骨大孔和第一颈椎之间分离，从断面孔可以看到脑干的尾部。４．１．２．１．３ 用锯锯开颅骨，取出整个脑组织（包括大脑、小脑和脑干）。４．１．２．１．４ 如果只取脑闩部位，可以不锯开颅骨，用特制取样勺直接从枕骨大孔处进行取样。具体方法是：将分离的牛头顶部朝下放置，用边缘锋利的特制取样勺从枕骨大孔处的脑和头骨之间的缝隙插入，贴着颅骨左右移动，切断两侧的颅神经，切记紧贴颅骨以避免损坏脑组织，插入大约７ｃｍ，然后向下切割，即将延髓尾部（可能会带有一些小脑的部分）与脑的其他部分分离。将勺子拔出，将分离的脑干从颅腔中滑出。脑闩部位的取材可按图１进行。图１ 脑闩部位的取材４．１．２．２ 牛海绵状脑病组织病理学、免疫组织化学诊断样品制备方法４．１．２．２．１ 修样４．１．２．２．１．１ 在ＢⅡ生物安全柜进行修样。４．１．２．２．１．２ 对于有神经症状的病例，取材方法为：在小脑脚处切除小脑，暴露脑干，沿神经轴的横向切下大约３ｃｍ～５ｃｍ长度的组织。采取的解剖学部位包括：脑闩部位延髓、小脑后脚部位延髓、脑桥、中脑包括前丘和红核部位、小脑（矢状切）、丘脑、大脑额叶和大脑枕叶。２犛犖／犜１３１６—２０１１４．１．２．２．１．３ 对于进行普查的病例，取材方法为：在脑闩部位横向切下延髓的一段。如果所取组织包括小脑，则先去除小脑后，再取脑闩部位。脑干区域取材可按图２进行。建议切取的水平部位：ＡＡ＝延髓 脑闩部位ＢＢ＝延髓 小脑后脚部位ＣＣ＝中脑 前丘部位图２ 切除小脑的脑干４．１．２．２．１．４ 将所取样品固定于１０倍体积的１０％的中性福尔马林溶液中。通常情况下（室温１８℃～２５℃），３ｄ后更换固定液。固定１周即可进行修样。４．１．２．２．１．５ 在刀板上将样品组织修成２ｍｍ～３ｍｍ厚的小块，装入脱水包埋盒中，放入１０％中性福尔马林溶液中固定过夜。４．１．２．２．１．６ 将装有组织的脱水包埋盒浸入９８％～９９％的甲酸溶液中，振荡１ｈ。４．１．２．２．１．７ 取出脱水包埋盒，自来水充分冲洗。４．１．２．２．１．８ 置于１０％中性福尔马林溶液中。４．１．２．２．２ 组织脱水、浸蜡将装有组织的脱水包埋盒放入自动脱水浸蜡机中，常规脱水浸蜡程序如下：ａ） １０％中性福尔马林溶液３０ｍｉｎ；ｂ） ７０％乙醇７５ｍｉｎ；ｃ） ９５％乙醇７５ｍｉｎ；ｄ） ９５％乙醇７５ｍｉｎ；ｅ） １００％乙醇７５ｍｉｎ；ｆ） １００％乙醇７５ｍｉｎ；ｇ） １００％乙醇７５ｍｉｎ；ｈ） 二甲苯３０ｍｉｎ；ｉ） 二甲苯４５ｍｉｎ；ｊ） 二甲苯４５ｍｉｎ；ｋ） 石蜡（熔点５８℃～６０℃）７５ｍｉｎ；ｌ） 石蜡（熔点５８℃～６０℃）１ｈ；ｍ） 石蜡（熔点５８℃～６０℃）１ｈ。４．１．２．２．３ 包埋（使用包埋机或手工包埋，包埋石蜡熔点５８℃～６０℃）浸蜡后，使用包埋机进行常规石蜡包埋，包埋后的模具置于冷台上，至石蜡完全冷却。将模具与冷却的石蜡块分开。将制备好的组织石蜡包埋块放到４℃冰箱中待用。４．１．２．２．４ 切片、展片４．１．２．２．４．１ 切片：将制备好的脑组织石蜡包埋块固定到切片机上，调整切片厚度为５μｍ，匀速转动３犛犖／犜１３１６—２０１１切片机手柄切片。４．１．２．２．４．２ 展片：将展片槽中的水加热到３７℃～４５℃，把石蜡包埋组织切片轻轻的移入展片槽中。４．１．２．２．４．３ 烘干：用处理好的载玻片将组织捞出，使之粘附于玻片的适当位置。将粘贴有石蜡包埋组织的载玻片放到烘干台（５０℃）上，烘干３０ｍｉｎ后置于３７℃温箱中过夜干燥。干燥后的组织切片在室温下保存，待检。４．１．２．２．５ 去除污染４．１．２．２．５．１ 将所有污染的平面喷洒２％次氯酸钠，放置１ｈ后用吸水纸拭干后，用水充分冲（擦）洗。４．１．２．２．５．２ 将所用器械浸泡于２ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液中２ｈ后充分冲洗。４．１．２．２．５．３ 将用过的吸水纸放入生物危险垃圾袋中，在安全柜中进行蒸发后，１３５℃高压３０ｍｉｎ。４．１．２．２．５．４ 剩余的样品重新放回福尔马林容器中，容器置于通风橱中至做出诊断。４．１．２．３ 蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法（犈犔犐犛犃）、试纸条检测方法准备方法４．１．２．３．１ 样品编号。４．１．２．３．２ 所有的样品通过完成检测记录能够追踪到。４．１．２．３．３ 在ＢⅡ生物安全柜中切割组织。４．１．２．３．４ 在ＢⅡ生物安全柜或安全罩内从延髓的脑闩部位切取一块组织，把脑闩切块放入天平上事先称量的匀浆管中，组织块应在０．４５ｇ～０．７０ｇ之间（最好是０．５ｇ～０．５５ｇ）。４．１．２．３．５ 在切板上修整组织块，用纸巾吸取多余的血液。用２％的漂白粉消毒切板和纸巾１ｈ，冲洗。把器械放入２ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠浸泡２ｈ，冲洗。在生物安全柜中将纸巾放入开口的生物危害袋中，１３５℃，高压消毒３０ｍｉｎ。４．１．２．３．６ 在放入组织块的匀浆管中加入１０倍体积的１×匀浆缓冲液（质量浓度），盖上盖子。４．１．２．３．７ 用ＦＡＳＴＨ１）或ＭｅｄｉＦＡＳＴＨ１）匀浆机自动匀浆４５ｓ。１） ＦＡＳＴＨ是由瑞士Ｐｒｉｏｎｉｃｓ公司提供的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。４．１．２．３．８ 每份样品吸取９００μＬ～１０００μＬ匀浆组织液到９６孔１．２ｍＬ的样品主板里。主板可在４℃保存或在－２０℃或－７０℃长期保存（１２个月）。所有步骤在室温条件下进行，主板和消化板每板有４８份样品。４．２ 组织病理学诊断４．２．１ 材料４．２．１．１ 被检组织４．２．１．１．１ 待检牛脑组织切片。４．２．１．１．２ 对照组织切片（用于苏木素伊红染色质控）。４．２．１．２ 试剂４．２．１．２．１ 二甲苯。４．２．１．２．２ 无水乙醇、９５％乙醇溶液、７０％乙醇溶液。４．２．１．２．３ 苏木素染色液（Ｇｉｌｌ’ｓ）（见Ａ．１）。４．２．１．２．４ 饱和碳酸锂溶液。４．２．１．２．５ 伊红染色液（见Ａ．２）。４犛犖／犜１３１６—２０１１４．２．１．２．６ 二级水（见ＧＢ／Ｔ６６８２）。４．２．１．２．７ 中性树胶。４．２．１．３ 仪器设备４．２．１．３．１ 自动染色机。４．２．１．３．２ 封片机。４．２．１．３．３ 光学显微镜。４．２．１．３．４ 盖玻片。４．２．１．３．５ 染色架。４．２．１．３．６ 温箱或恒温孵育器（５８℃～６０℃）。４．２．１．３．７ 移液器及适配吸头。４．２．１．３．８ 磁力搅拌器。４．２．２ 方法４．２．２．１ 熔蜡将待染切片置于５８℃～６０℃的温箱中至少１ｈ进行熔蜡。４．２．２．２ 苏木素伊红（犎．犈）染色将待检牛脑组织切片和对照组织切片置于染色架上，放入自动染色机，也可以手动染色。染色程序如下：ａ） 二甲苯３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｂ） 二甲苯３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｃ） １００％乙醇３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｄ） １００％乙醇３ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｅ） ９５％乙醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ；ｆ） ９５％乙醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ；ｇ） ７０％乙醇３ｍｉｎ～５ｍｉｎ；ｈ） 自来水洗１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｉ） 苏木素１０ｓ（根据染色液状况调整）；ｊ） 自来水洗４ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｋ） 饱和碳酸锂１ｍｉｎ～２ｍｉｎ；ｌ） 自来水洗４ｍｉｎ～１０ｍｉｎ；ｍ） ７０％乙醇１ｍｉｎ～３ｍｉｎ；ｎ）