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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８６８—２０１１西尼罗病毒病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狑犲狊狋狀犻犾犲犳犲狏犲狉２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准参考了国际动物卫生组织（ＯＩＥ）的《诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）（ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ）２．１．２０章和有关行业标准、文献制定，补充了ＲＴＰＣＲ和实时荧光ＲＴＰＣＲ的检测方法。本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邱璐、李健、姜焱、熊炜、周晓黎、蒋静、胡永强。Ⅰ犛犖／犜２８６８—２０１１西尼罗病毒病检疫技术规范１ 范围本标准规定了西尼罗病毒病临床诊断和实验室诊断。本标准适用于西尼罗病毒病病原及抗体的检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 临床诊断３．１ 发病症状人和马感染后，多数不出现症状，部分感染者发生伴有类似流感症状的西尼罗热，少量严重的病例出现高热、剧烈头痛、颈项强直、昏迷、抽搐等中枢神经系统体症，发生西尼罗脑炎，甚至死亡。３．２ 流行病学西尼罗病毒（ｗｅｓｔｎｉｌｅｖｉｒｕｓ，ＷＮＶ）为单链ＲＮＡ病毒，属黄病毒科黄病毒属。病毒呈球形，基因组编码三种结构蛋白（Ｃ、ｐｒＭ和Ｅ蛋白）与七种非结构蛋白。西尼罗病毒在抗原性上与同属黄病毒的日本乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Ｋｕｎｊｉｎ病毒、登革病毒相似，在血清学检测时，易产生交叉反应。西尼罗病毒于１９３７年首次分离，经蚊媒传播可引起人类或动物的西尼罗热及西尼罗脑炎。鸟类、马、人等哺乳动物都是易感动物。其中鸟类是主要的储存宿主。该病在２０世纪５０年代～９０年代都曾有过流行，特别是２０世纪９０年代以后，流行区呈扩大趋势，范围遍及非洲、欧洲、中东、西亚、中亚、大洋洲和北美洲等广大地区。目前我国尚无该病流行的报道，但随着全球气候变暖，疫源地旅行传播以及生物媒介等潜在因素的存在，为西尼罗病毒的传播提供了可能。加之该病毒目前在我国周边国家如印度、俄罗斯南部、东南亚等国已有报道，我国人群普遍缺乏对该病毒的免疫力，一旦传入，将导致严重的公共卫生灾难。４ 实验室诊断４．１ 西尼罗病毒犚犜犘犆犚、实时荧光犚犜犘犆犚检测及套式犘犆犚检测４．１．１ 方法介绍可以进行西尼罗病毒核酸检测。本标准提供的三种核酸检测方法可以根据具体情况选择采用。ＰＣＲ试验的前处理操作可以在ＢＳＬ２实验室进行。在对人、活动物或尸体进行取样时，采样人员应佩戴个人防护设施，穿戴防护衣，佩戴防护口罩、面罩、手套。１犛犖／犜２８６８—２０１１４．１．２ 设备、材料和试剂４．１．２．１ 设备、材料４．１．２．１．１ ＰＣＲ仪。４．１．２．１．２ 实时荧光ＰＣＲ检测仪。４．１．２．１．３ 电泳仪。４．１．２．１．４ 凝胶成像分析系统。４．１．２．１．５ 高速台式冷冻离心机。４．１．２．１．６ 普通台式离心机。４．１．２．１．７ 匀浆器。４．１．２．１．８ 微量可调移液器。４．１．２．１．９ 无ＲＮａｓｅ的离心管、吸头和无ＲＮａｓｅ的玻璃容器。４．１．２．２ 试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无ＲＮａｓｅ污染的容器（用ＤＥＰＣ水处理后高压灭菌）分装。试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２规定。４．１．２．２．１ 裂解液：Ｔｒｉｚｏｌ或其他。４．１．２．２．２ 异丙醇。４．１．２．２．３ 犜犪狇ＤＮＡ酶。４．１．２．２．４ ７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，－２０℃预冷。４．１．２．２．５ ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。４．１．２．２．６ 逆转录酶。４．１．２．２．７ ＤＥＰＣ水：用ＤＥＰＣ处理后的水。４．１．２．２．８ ５０×ＴＡＥ缓冲液。４．１．３ 采样、送检和处理４．１．３．１ 人员样本采集４．１．３．１．１ 采集来自于疫区的人员、入境可疑人员、申请检验人员的血液。４．１．３．１．２ 采集怀疑死于西尼罗病人员的血液、脑髓液、组织样品，特别是脑组织和神经组织样品。４．１．３．２ 动物及产品样本采集４．１．３．２．１ 采集来自疫区的活动物的血清。４．１．３．２．２ 采集来自疫区的疑似感染的动物的脑、脊髓、其他组织样品，特别是神经组织样本。４．１．３．３ 禽鸟和蚊虫样本采集４．１．３．３．１ 采集来自疫区的贸易鸟、禽类的血清。４．１．３．３．２ 采集迁徙的鸟类血清。４．１．３．３．３ 采集来自疫区包装箱内的死鸟、死禽的脑、其他组织样本。４．１．３．３．４ 采集来自西尼罗疫区的藏匿于交通工具、运输设备中的蚊虫或以其他方式藏匿的蚊虫样本。特别是库蚊和饱血蚊虫。４．１．３．４ 来自西尼罗病毒病疫区的交通工具、运输设备的样本采集取样时将棉拭子用无菌ＰＢＳ浸润后，在面积为５ｃｍ２×５ｃｍ２区域内横直各擦拭１０次，并不断转２犛犖／犜２８６８—２０１１换拭面，然后将拭子棉花端倾入装有ｐＨ７．２～７．４ＰＢＳ液的试管中。４．１．３．５ 样本的送检和处理４．１．３．５．１ 采样过程中样本不得交叉污染。样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品，放一个塑料袋，于保温箱中加冰、密封，送实验室。采集或处理的样本在２℃～８℃条件下保存应不超过２４ｈ；若需长期保存，应放置－７０℃冰箱，冻融不超过３次。４．１．３．５．２ 血清或血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。４．１．３．５．３ 病毒培养物：用无菌滴管直接吸取至无菌离心管中，编号备用。４．１．３．５．４ 蚊体、神经或其他组织脏器：取待检样品２．０ｇ置于匀浆器中，加入１０ｍＬＰＢＳ匀浆，然后将组织悬液转入离心管中３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。４．１．３．５．５ 拭子：将装有拭子的试管在混旋仪上充分混旋提取，挤干拭子，取上清液。试管编号备用。４．１．４ 操作步骤４．１．４．１ 引物和探针的设计参见表Ａ．１～表Ａ．３。４．１．４．２ 样本核酸提取４．１．４．２．１ 在样本制备区进行。取狀个灭菌的１．５ｍＬ离心管，其中狀为被检样品数、一份阴性、一份阳性对照数量之和，对每管进行编号（阳性对照为ＤＮＡ，无需此步骤）。４．１．４．２．２ 每管加入１ｍＬ裂解液，然后分别加入４．１．３．５处理后的被检样本、阴性对照、阳性对照各３００μＬ，一份样本换用一个吸头，再加入２００μＬ三氯甲烷，充分振荡均匀（如使用旋涡振荡器，避免振荡过于强烈产生乳化层）。在４℃条件下，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。４．１．４．２．３ 取与４．１．４．２．１中相同数量的１．５ｍＬ灭菌的离心管，加入４００μＬ预冷的异丙醇，将上步离心后样品及对照的上清液５００μＬ转移至相应的各管，避免吸到中间层，盖紧瓶盖，颠倒混均。－２０℃冰箱静置３０ｍｉｎ。４．１．４．２．４ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，每管加入５００μＬ７５％乙醇，颠倒洗涤。４．１．４．２．５ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，轻轻倒去上清液，吸去残余液体，室温下干燥５ｍｉｎ。４．１．４．２．６ 将抽提的ＲＮＡ溶解在２０μＬＤＥＰＣ水中待用。４．１．４．３ 检测４．１．４．３．１ 犘犆犚反应体系建议的三种ＰＣＲ检测反应体系参见表Ａ．４～表Ａ．６。每个样本设两个平行，每次反应应带阴性、阳性对照。可以采用两步法进行。４．１．４．３．２ 反应参数４．１．４．３．２．１ 普通ＲＴＰＣＲ反应参数：４２℃，６０ｍｉｎ；９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，２０ｓ，５５℃，２０ｓ，７２℃，１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃，３ｍｉｎ；２５℃，１５ｓ。４．１．４．３．２．２ 荧光ＲＴＰＣＲ反应参数：４２℃，６０ｍｉｎ；９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，１５ｓ，５０℃，１５ｓ，７２℃，３０ｓ，５个循环；９４℃，１５ｓ，５８℃，４０ｓ，４０个循环（每个循环的第二步搜集荧光）。４．１．４．３．２．３ 套式ＰＣＲ反应参数：３犛犖／犜２８６８—２０１１第一步反应：７０℃，１０ｍｉｎ；４５℃，４５ｍｉｎ；９５℃，１１ｍｉｎ；９５℃，３０ｓ，５５℃，４５ｓ，７２℃，６０ｓ，３５个循环；７２℃，５ｍｉｎ；２５℃，１５ｓ。第二步反应：９５℃，３０ｓ，５５℃，４５ｓ，７２℃，６０ｓ，３５个循环；７２℃，５ｍｉｎ；２５℃，１５ｓ。４．１．４．３．３ 普通犚犜犘犆犚和套式犘犆犚产物的电泳检测将５０×ＴＡＥ稀释成工作浓度，配制１．５％琼脂糖溶液，加热溶解，略为冷却后加入溴化乙锭储备液，使溴化乙锭的含量为０．５μｇ／ｍＬ，铺板。取１０μＬＰＣＲ反应产物，加２μＬ上样缓冲液，进行电泳。根据情况，选择恒定电流或恒定电压模式，当溴酚蓝迁移至接近凝胶末端三分之二处时，停止电泳。用凝胶成像系统记录结果。若发现条带的大小与阳性结果一致时，将ＰＣＲ产物进行测序，再与数据库中序列进行比对。４．１．５ 结果判定４．１．５．１ 普通犚犜犘犆犚结果判定检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小扩增条带，样品未出现预期条带，则判定样品为阴性。检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现预期大小扩增条带，并且对样品的ＰＣＲ产物进行测序分析，若证实与西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。反之，则判断为阴性。４．１．５．２ 荧光犚犜犘犆犚结果判定４．１．５．２．１ 总则可以作为核酸检测的筛选试验。如要确诊，则需要进行普通ＲＴＰＣＲ试验并进行测序，或者其他相关试验完成。４．１．５．２．２ 荧光犚犜犘犆犚结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。４．１．５．２．３ 荧光犚犜犘犆犚质控标准阴性对照无Ｃｔ值并且无扩增曲线。阳性校准品应呈现出典型的阳性扩增曲线。如阴性对照和阳性校准品扩增曲线不满足以上条件，此次实验视为无效。４．１．５．２．４ 判定当样品的Ｃｔ值大于或等于４０，并且未出现扩增曲线，则判断为阴性。当样品的Ｃｔ值小于或等于３０时，同时出现典型的扩增曲线，则判断为阳性。当样品的Ｃｔ值大于３０而小于４０，并出现扩增曲线时，建议复检，复检后的Ｃｔ值仍然小于４０，并出现扩增曲线，可判断为阳性。若Ｃｔ值大于４０，则判断为阴性。４．１．５．３ 套式犚犜犘犆犚结果判定检测后，阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照在２４８ｂｐ出现扩增条带。如样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，则样品疑似阳性，通过对样品的ＰＣＲ产物进行测序４犛犖／犜２８６８—２０１１分析，证实与数据库公布的西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。如样品出现的条带大小与阳性对照接近，则实验需从ＲＮＡ提取开始重新进行，最终结果需通过测序最后判定。４．１．５．４ 结果描述以西尼罗病毒核酸阴性或核酸阳性对结果进行描述。４．２ 西尼罗病毒抗体捕捉犈犔犐犛犃检测４．２．１ 检测方法介绍可以对西尼罗病毒抗体进行检测。４．２．２ 设备、材料和试剂４．２．２．１ 酶标仪。４．２．２．２ 洗板机。４．２．２．３ 可调移液器。４．２．２．４ 包被缓冲液：０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液，ｐＨ７，２，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。４．２．２．５ 稀释缓冲液或洗液（ＰＢＳＴ）：０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液，ｐＨ７．２，含０．０５％Ｔｗｅｅｎ，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。４．２．２．６ 封闭缓冲液：以ＰＢＳＴ配制的５％脱脂奶粉溶液，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。４．２．２．７ 显