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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７５４．１１—２０１１出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第１１部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌犔狅狅狆犿犲犱犻犪狋犲犱犻狊狅狋犺犲狉犿犪犾犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犲狓狆狅狉狋犳狅狅犱—犘犪狉狋１１：犆犺狅犾犲狉犪狋狅狓犻狀狆狉狅犱狌犮犻狀犵犞犻犫狉犻狅犮犺狅犾犲狉犪犲２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２７５４《出口食品中致病菌环介导恒温扩增（ＬＡＭＰ）检测方法》共分为１５个部分：———第１部分：金黄色葡萄球菌；———第２部分：大肠杆菌Ｏ１５７；———第３部分：志贺氏菌；———第４部分：单核细胞增生李斯特菌；———第５部分：副溶血性弧菌；———第６部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌；———第７部分：空肠弯曲菌；———第８部分：肺炎克雷伯氏菌；———第９部分：溶血性链球菌；———第１０部分：产气荚膜梭菌；———第１１部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌；———第１２部分：溶藻弧菌；———第１３部分：创伤弧菌；———第１４部分：假结核耶尔森氏菌；———第１５部分：阪崎肠杆菌。本部分为ＳＮ／Ｔ２７５４的第１１部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏盐城出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、广州华峰生物科技有限公司。本部分主要起草人：曾静、魏海燕、张西萌、王志强、冯家望、李志勇、郑晶、郑文杰、徐帮兴、易敏英、罗雁非、曹以诚、高东微。Ⅰ犛犖／犜２７５４．１１—２０１１出口食品中致病菌环介导恒温扩增（犔犃犕犘）检测方法第１１部分：产霍乱毒素的霍乱弧菌１ 范围ＳＮ／Ｔ２７５４的本部分规定了检测出口食品中产霍乱毒素霍乱弧菌的环介导恒温核酸扩增（ＬＡＭＰ）法。本部分适用于出口食品中产霍乱毒素的霍乱弧菌的筛选检测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求ＧＢ／Ｔ２７４０３ 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测ＳＮ／Ｔ１０２２ 出口食品中霍乱弧菌检验方法３ 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测霍乱弧菌，所有培养物和废弃物应按照ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。４ 防污染措施防止污染措施应符合ＧＢ／Ｔ２７４０３的规定。５ 缩略语下列缩略语适用于本文件。Ｂｅｔａｉｎｅ：甜菜碱犅狊狋酶［犅狊狋ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔ）］：犅狊狋ＤＮＡ聚合酶（大片段）ＣＴ：（ｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎ）：霍乱毒素犮狋狓Ａ（ｃｈｏｌｅｒａｔｏｘｉｎｓｕｂｕｎｉｔＡｇｅｎｅ）：霍乱毒素Ａ亚单位基因ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）：脱氧核糖核酸ｄＮＴＰ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）：脱氧核苷三磷酸ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）：乙二胺四乙酸ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：环介导恒温扩增１犛犖／犜２７５４．１１—２０１１ＴｒｉｔｏｎＸ１００：聚乙二醇辛基苯基醚６ 技术概要根据霍乱弧菌属特有的靶序列犮狋狓Ａ基因（参见附录Ａ）设计特异性内引物、外引物和环状引物各一对，特异性识别靶序列上的八个独立区域，利用犅狊狋酶启动循环链置换反应，在犮狋狓Ａ基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎环ＤＮＡ混合物；从ｄＮＴＰ析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Ｍｇ２＋结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。７ 试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的要求。７．１ 引物：根据霍乱弧菌属特有的靶序列犮狋狓Ａ基因设计一套特异性引物，包括外引物１，外引物２，内引物１，内引物２和环状引物１，环状引物２。外引物扩增片段长度：２４２ｂｐ。外引物１（Ｆ３，５’３’）：ＧＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴＡＴＣＧＧ外引物２（Ｂ３，５’３’）：ＧＭＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴＧＡＣＣ内引物１（ＦＩＰ，５’３’）：ＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧ内引物２（ＢＩＰ，５’３’）：ＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＴＧＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡ环状引物１（ＬＦ，５’３’）：ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡ环状引物２（ＬＢ，５’３’）：ＡＡＣＴＣＡＧＡＣＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧ７．２ ＤＮＡ提取液：含２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ和１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００。７．３ ｄＮＴＰ：１０ｍｍｏｌ／Ｌ。７．４ 犅狊狋酶：８Ｕ／μＬ。７．５ １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ缓冲液：含２００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸铵、１００ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾、２０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸镁、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００。７．６ 硫酸镁：５０ｍｍｏｌ／Ｌ。７．７ 甜菜碱：５ｍｏｌ／Ｌ。７．８ 显色液：ＳＹＢＲＧｒｅｅｎⅠ荧光染料，１０００×。７．９ 阳性对照：霍乱弧菌标准菌株，或含目的片段的ＤＮＡ亦可。７．１０ １．５ｍＬ塑料离心管。８ 仪器和设备８．１ 移液器：量程０．５μＬ～１０μＬ；量程１０μＬ～１００μＬ；量程１００μＬ～１０００μＬ。８．２ 高速台式离心机：≥７０００犵。８．３ 水浴锅或加热模块：６５℃±１℃和１００℃±１℃。８．４ 计时器。９ 检测程序食品中产霍乱毒素的霍乱弧菌ＬＡＭＰ检测程序见图１。２犛犖／犜２７５４．１１—２０１１图１ 食品中产霍乱毒素的霍乱弧菌犔犃犕犘检测程序１０ 操作步骤１０．１ 样品制备、增菌培养按照ＳＮ／Ｔ１０２２中方法进行样品制备和增菌。１０．２ 细菌模板犇犖犃的制备１）１０．２．１ 增菌液模块犇犖犃的制备１） 采用下述方法，也可使用等效的商品化的ＤＮＡ提取试剂盒，并按其说明提取制备模板ＤＮＡ。 对于１０．１获得的增菌液，采用如下方法制备模板ＤＮＡ：ａ） 取增菌液１ｍＬ加到１．５ｍＬ无菌离心管中，７０００犵离心２ｍｉｎ，尽量吸弃上清液；ｂ） 加入５０μＬＤＮＡ提取液，混匀后沸水浴１０ｍｉｎ，置冰上１０ｍｉｎ；ｃ） 于７０００犵离心２ｍｉｎ，上清液即为模板ＤＮＡ；取上清液置－２０℃可保存６个月备用。１０．２．２ 可疑菌落模板犇犖犃的制备对于１０．１分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，再按照１０．２．１ｂ）步骤制备模板ＤＮＡ以待检测。１０．３ 环介导恒温核酸扩增１０．３．１ 反应体系产霍乱毒素的霍乱弧菌ＬＡＭＰ反应体系见表１。３犛犖／犜２７５４．１１—２０１１表１ 产霍乱毒素的霍乱弧菌犔犃犕犘反应体系组 分工作液浓度加样量μＬ反应体系终浓度ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ缓冲液１０×２．５１×外侧上游引物（Ｆ３）１０μｍｏｌ／Ｌ０．５０．２μｍｏｌ／Ｌ外侧下游引物（Ｂ３）１０μｍｏｌ／Ｌ０．５０．２μｍｏｌ／Ｌ内侧上游引物（ＦＩＰ）５０μｍｏｌ／Ｌ０．８１．６μｍｏｌ／Ｌ内侧下游引物（ＢＩＰ）５０μｍｏｌ／Ｌ０．８１．６μｍｏｌ／Ｌ环状上游引物（ＬＦ）５０μｍｏｌ／Ｌ０．４０．８μｍｏｌ／Ｌ环状下游引物（ＬＢ）５０μｍｏｌ／Ｌ０．４０．８μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ１０ｍｍｏｌ／Ｌ３．５１．８μｍｏｌ／Ｌ甜菜碱５ｍｏｌ／Ｌ４０．８ｍｏｌ／Ｌ硫酸镁５０ｍｍｏｌ／Ｌ３６ｍｍｏｌ／Ｌ犅狊狋ＤＮＡ聚合酶８Ｕ／μＬ１０．３２Ｕ／μＬＤＮＡ模板—３—去离子水—４．６—１０．３．２ 反应过程１０．３．２．１ 按表１所述配制反应体系。１０．３．２．２ ６３℃恒温扩增９０ｍｉｎ，８０℃２ｍｉｎ使酶失活，反应即结束。１０．３．３ 空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以水代替ＤＮＡ模板。阴性对照以ＤＮＡ提取液代替ＤＮＡ模板。阳性对照制备：将霍乱弧菌标准菌株接种于３％氯化钠碱性蛋白胨水（ＡＰＷ）中３６℃±１℃培养１８ｈ～２４ｈ，用无菌生理盐水稀释至约１０６ＣＦＵ／ｍＬ～１０８ＣＦＵ／ｍＬ（约麦氏浊度０．４），按１０．２．１提取模板ＤＮＡ作为ＬＡＭＰ反应的模板。１０．４ 结果观察在上述反应管中加入２μＬ显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。１０．５ 结果判定和报告在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：ａ） 待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为霍乱弧菌初筛阳性，对样品的增菌液或可疑纯菌落进一步按ＳＮ／Ｔ１０２２中操作步骤进行确认后报告结果；ｂ） 待检样品反应管液体呈橙色，则可报告霍乱弧菌检验结果为阴性。若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。４犛犖／犜２７５４．１１—２０１１附 录 犃（资料性附录）产霍乱毒素的霍乱菌犮狋狓犃基因序列（部分）及引物设计示意图（犪犮犮犲狊狊犻狅狀狀狅．犓０２６７９）Ｆ３（５’３’）：ＧＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＴＡＡＧＴＴＡＴＡＴＣＧＧＢ３（５’３’）：ＧＭＣＣＡＧＡＣＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴＧＡＣＣＦＩＰ（Ｆ１ｃ＋Ｆ２５’３’）：ＴＣＴＧＴＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＴＡＡＧＡＣＧＣＡＧＡＴＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧＢＩＰ（Ｂ１ｃ＋Ｂ２５’３’）：ＴＣＡＡＣＣＴＴＴＡＴＧＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＬＦ（５’３’）：ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＣＡＬＢ（５’３’）：ＡＡＣＴＣＡＧＡＣＧＧＧＡＴＴＴＧＴＴＡＧＧ注：下划线标注序列为产霍乱毒素的霍乱弧菌ＬＡＭＰ引物设计所选取的８个区域，黑色字体为ＬＡＭＰ引物所用到的序列。Ｆ３和Ｂ３分别是外侧上游引物和外侧下游引物；ＦＩＰ和ＢＩＰ分别是内侧上游引物和内侧下游引物；ＬＦ和ＬＢ是环状上游引物和环状下游引物。５犛犖／犜２７５４．１１—２０１１