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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!!!!#牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程$%&’&(&)&*+&),-.%/0.(1/23%./(’2&3!$45*&%!#$%&’$()((*+#*%(*,!#6$!6!%发布!&6#6$实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准的附录!为规范性附录!本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口!本标准起草单位中华人民共和国上海出入境检验检疫局#华中农业大学!本标准主要起草人李树清#胡永强#赵俊龙#王巧全#陈志飞#杜凯#王贵强#刘焕章!本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准!!!!#!!!!#牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程$!范围本标准规定了温氏附红细胞体聚合酶链式反应方法!本标准适用于温氏附红细胞体的鉴定和检测!!!概述温氏附红细胞体$!#$%&’$()((*+#*%(*,%!-+#*%(*,&是附着于牛的红细胞或游离于胞浆的一种立克次氏体%可通过吸血昆虫#螨虫#母体胎盘#血液等传播!牛感染!-+#*%(*,一般不表现临床症状%严重感染引起发热#消瘦和黄疸!本标准根据!-+#*%(*,#$%&’!的保守序列%设计了一对特异引物()*’()&+%通过,-&反应可扩增出.+/01的片段%用于温氏附红细胞体的鉴定和检测!%!设备和材料%2$!仪器设备%2$2$!,-&扩增仪!%2$2!!电泳仪!%2$2%!凝胶成像系统!%2$2&!微波炉!%2$2’!可调移液器$34%54%554%3554%5554&!%2$2(!离心机!%2$2#!天平$525556&!%2$2)!水浴锅!%2!!耗材%2!2$!,-&反应管!%2!2!!27(4离心管!%2!2%!移液器滴头!%2%!试剂%2%2$!三蒸水525+8,9灭菌7(:;!%2%2!!琼脂糖!%2%2%!溴化乙锭!%2%2&!./0酶$7’4&!%2%2’!5=,-&反应缓冲液!%2%2(!氯化镁$86-3&37((?’4!%2%2#!((?’4@’A,!%2%2)!苯酚B三氯甲烷B异戊醇$37C3DC&!%2%2*!分子量指示物5501#355501E’!89%FG%!%2%2$!75(6’(4溶菌酶#5H$E$#5(6’(4蛋白酶I#7(?’4氯化钠$’9-H十六烷基三甲基溴化铵$-A!J(?’4乙酸钠$’9!K&#.5H乙醇#5(6’(4溴化乙锭$LJ&#A%:MB乙酸电泳缓冲!!#!!!!#液$A!LH琼脂糖凝胶##=加样缓冲液#+2/H柠檬酸钠#27H乙二胺四乙酸二钠$LEA!二钠&的配制见附录!!除另有规定%所用化学试剂均为分析纯!%2&!引物引物序列见表!引物用灭菌三蒸水配成55(?’4母液%N35O冻存!使用时用灭菌三蒸水配成7(?’4的工作液!表$!试验所用引物序列引物核苷酸序列引物浓度’$(?’4&引物位置产物大小’01()*97PB6Q99Q9K9Q9QQQ99KQQ9KQQQQ9K6B+P75#B+3%3.01$!RSD#3##&()&+07PB96K9KQK69KQ969Q6QKB+P7/3#B/D+%/01$!RSD#3##&.+/!!9上游引物T?%)9%@1%:(G%!!!0下游引物%GUG%MG1%:(G%!&!操作步骤&2$!样品采集无菌采牛血%用+2/H柠檬酸钠或27HLEA!二钠抗凝作为临床检测样品!&2!!样品处理D554抗凝血加54溶菌酶$75(6’(4&涡旋混匀%+.O下温育V(加入.545H$E$%#4蛋白酶I$5(6’(4&%#7O下温育5(:;(加入5547(?’4氯化钠%#54-A!J%#7O下温育5(:;(加入等体积的苯酚B三氯甲烷B异戊醇抽提%常温下3555=1离心5(:;(取上清液%再次加入等体积的苯酚B三氯甲烷B异戊醇抽提%常温下3555=1离心5(:;(取上清液%加入两倍体积的无水乙醇和’5体积的3(?’4的乙酸钠%N35O沉淀+5(:;%+555=1DO离心5(:;(弃上清液%沉淀用冷.5H乙醇洗一次%自然干燥(用354的三蒸水溶解%N35O保存备用!&$%!%&’&$%$$!对照设立)))阳性对照用!-+#*%(*,#$%&’!部分序列连接在,8E/BA载体上构建的重组质粒()))阴性对照用健康牛抗凝血提取的E’!作为对照()))空白对照用灭菌三蒸水!&$%$!!%&’反应体系总体积+54%5=,-&反应缓冲液+4(氯化镁$86-3&+4(@’A,+4(引物()*和()&+各4(阳性对照$5;6#35;6E’!&或样品4(5234./0E’!聚合酶%/4三蒸水!&2%2%!循环参数,-&反应循环参数为SDO+(:;(SDO+5M%75O+5M%.3O(:;%+7个循环(最后.3O+(:;!&2%2&!电泳取,-&产物54与34#=加样缓冲液混合%加样于含LJ的27H琼脂糖凝胶中!在=A!L缓冲液中%+W’K(#DW’K(电泳约+5(:;%当溴酚蓝到达底部时停止电泳%用凝胶成像系统分析!阳性#阴性#空白对照和E’!分子量指示物同样电泳!3!!#!!!!#’!结果判定’2$!对照)))阳性对照出现.+/01的E’!片段()))阴性和空白对照不出现任何E’!片段()))对照成立才能进行判定!’2!!样品判定样品经,-&扩增后)))无核酸带或带的大小不在.+/01E’!位置上判为温氏附红细胞体阴性()))在.+/01E’!位置上有核酸带%判为温氏附红细胞体阳性()))阳性样品进行测序%将序列与XG;09;F中温氏附红细胞体#$%&’!序列进行比较确诊!+!!#!!!!#附!录!($规范性附录&试剂配制($$!’)*!)+溶菌酶溶菌酶!!75(6加三蒸水至(4%溶解分装后%N35O保存备用!($!!$,十二烷基硫酸钠$!-!&的配制$E$!!!!56加三蒸水!!S5(4#/O加热助溶%用浓盐酸调1Y至.23%三蒸水定容至55(4!($%!$)*!)+蛋白酶.的配制蛋白酶I!!55(6加三蒸水!!5(4溶解分装后%N35O保存备用!($&!’)/0!+氯化钠$1&0&的配制氯化钠$’9-&!!3S236加三蒸水!!!!/5(4加热%搅拌溶解后定容至55(4%525+8,9灭菌7(:;备用!($’!’,&#(2的配制氯化钠$’9-&!!32576-A!J!!!!!76用三蒸水/5(4溶解’9-%缓慢加入-A!J$十六烷基三甲基溴化铵&%同时加热并搅拌%溶解后定容至55(4!($(!!)/0!+乙酸钠$1(3&乙酸钠$’9!K*+Y3Z&3.36加三蒸水定容至555(4%用+(?’4乙酸调1Y至723!($#!#,乙醇无水乙醇!!.5(4加三蒸水定容至55(4%混匀DO备用!($)!$)*!)+溴化乙锭$42&的配制LJ!!6加三蒸水定容至55(4%磁力搅拌至完全溶解%室温避光保存!D!!#!!!!#($*!#5678乙酸电泳缓冲液$#(4&的配制($*$$!$’)/0!+9:)$乙二胺四乙酸二钠$4-#(二钠&的配制LEA!二钠!!/#26三蒸水!!!!/55(4磁力搅拌器上剧烈搅拌%用氢氧化钠$’9ZY&调节1Y至/25$约356氢氧化钠颗粒&%加三蒸水定容至555(4!525+8,9灭菌7(:;备用!($*$!!’+#(4的配制三$羟甲基&氨基甲烷$A%:M碱&!!3D36冰乙酸!!!!!!!!!!!!7.2(4527(?’4LEA!$1Y/25&!!!55(4加三蒸水定容至555(4%混匀DO保存备用!临用前作75倍稀释!($*$%!$+#(4使用液的配制75=A!L!!35(4加三蒸水定容至555(4%混匀备用!($$!$$’,琼脂糖凝胶的配制琼脂糖!276加=A!L定容至55(4%完全融化后%溶液冷却至#5O%加5(6’(4LJ74$终浓度5276’(4&%轻轻混匀后%倒板!($$$!(+加样缓冲液的配制溴酚蓝!!!52376蔗糖!!!!D56加三蒸水!!至55(4混匀%置DO保存备用!($$!!%$),柠檬酸钠$柠檬酸三钠&的配制柠檬酸钠!!+2/6加三蒸水!!至55(4混匀%525.8,9灭菌7(:;备用!使用时与血的比例为C5!($$%!$$’,乙二胺四乙酸二钠$4-#(二钠&的配制LEA!二钠!!276加三蒸水!!!至55(4混匀%分装52D(4’瓶%55O烘干后可抗凝7(4血液!7!!#!!!!#书书书!#!###!#中华人民共和国出入境检验检疫行业标准牛温氏附红细胞体聚合酶链式反应操作规程!!#$%$$$%%&!中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街’(号邮政编码#’%%%)*网址+++,-./,012,/0电话#(3*$45)((3*’&*)3中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷!开本33%6’$4%’!’(印张%,&*字数’%千字$%%3年4月第一版$%%3年4月第一次印刷印数’$%%%!书号#’**%(($$7’3)5(定价$,元