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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５１．２—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２，ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４对虾白斑病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狑犺犻狋犲狊狆狅狋犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ１１５１系列标准共分为六部分：———虾桃拉综合征检疫技术规范———对虾白斑病检疫技术规范———斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）诊断方法———虾黄头病检疫技术规范———对虾杆状病毒（ＢＰ）检验方法———对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程本部分为ＳＮ／Ｔ１１５１的第２部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２《对虾白斑病毒（ＷＳＶ）聚合酶链式反应（ＰＣＲ）检测方法》和ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４《对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２和ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４相比，主要技术变化如下：增加了临床症状和综合判定方法。本部分主要参考世界动物卫生组织（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）中２．２．５章。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中国水产科学研究院黄海水产研究所、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：何俊强、刘荭、黄倢、杨冰、雷质文、岳志芹、高隆英、江育林、史秀杰。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５１．２—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１５１．６—２００４。Ⅰ犛犖／犜１１５１．２—２０１１对虾白斑病检疫技术规范１ 范围ＳＮ／Ｔ１１５１的本部分规定了对虾白斑病的ＰＣＲ、斑点杂交和原位杂交等检测方法。本部分适用于对虾白斑病的流行病学调查、监测、诊断和检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样３ 缩略语下列缩略语适用于本文件ＷＳＤ（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｄｉｓｅａｓｅ）：对虾白斑病ＷＳＶ（ｗｈｉｔｅｓｐｏｔｖｉｒｕｓ）：对虾白斑病毒ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＮＢＴ（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）：氮蓝四唑ＢＣＩＰ（５ｂｒｏｍｏ４ｃｈｌｏｒｏ３ｉｎｄｏｙｌ）：５溴４氯３吲哚磷酸甲苯胺盐ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）：二甲基甲酰胺４ 概述ＷＳＤ是由ＷＳＶ引起的一种对虾传染性疾病，是全世界养殖对虾中危害最为严重的对虾病毒病，已被列入世界动物卫生组织（ＯＩＥ）水生动物疫病名录，同时被我国列入一类动物疫病名录。病毒粒子从杆状到椭圆状，带有三层囊膜，粒子较大（８０ｎｍ～１２０ｎｍ×２５０ｎｍ～３８０ｎｍ）。基因组大小为２９０ｋｂ。感染细胞肥大的核内能产生ＷＳＶ特征性的包涵体。５ 试剂材料及仪器设备本标准所用试剂如无特殊说明均为分析纯试剂。试验用水符合ＧＢ／Ｔ６６８２一级水的要求。５．１ 犜犪狇酶：－２０℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化。５．２ ｄＮＴＰ：ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏＬ／Ｌ。５．３ 引物：两对引物浓度为４０μｍｏＬ／Ｌ，其序列分别为：１４６Ｆ１：５’ＡＣＴＡＣＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＴＡＴＣＴＡＧ３’１４６Ｒ１：５’ＴＡＡＴＧＣＧＧＧＴＧＴＡＡＴＧＴＴＣＴＴＡＣＧＡ３’１犛犖／犜１１５１．２—２０１１１４６Ｆ２：５’ＧＴＡＡＣＴＧＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡ３’１４６Ｒ２：５’ＴＡＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＴＧＴ３’５．４ 乙醇：预冷的无水乙醇于－２０℃保存，不需预冷的无水乙醇于常温保存。５．５ ＤＩＧ标记的核酸探针：按照国家发明专利ＺＬ１１１３３６．４和实用新型专利ＺＬ２１５０６８．９（专利权人为中国水产科学研究院黄海水产研究所）所提供的技术制备。５．６ ＳＥＭＰｔｒｉｓ研磨液：按照国家发明专利ＺＬ１１１３３６．４和实用新型专利ＺＬ２１５０６８．９（专利权人为中国水产科学研究院黄海水产研究所）所提供的技术制备。５．７ 其他试剂：碱性磷酸酶标记的ＤＩＧ抗体（０．７５Ｕ／μＬ）、ＮＢＴ、ＢＣＩＰ、ＤＭＦ、二甲苯、中性树胶。５．８ ＰＣＲ扩增仪。５．９ 电泳仪。５．１０ 凝胶成像仪。５．１１ 程控石蜡切片机或常规手工切片：可切５μｍ～７μｍ厚的石蜡组织切片。５．１２ 水浴锅：４０℃～５０℃。５．１３ 烘片机：６０℃～１００℃。５．１４ 显微镜。５．１５ 恒温培养箱：８０℃±１℃。５．１６ 冷冻台式离心机：最高转速可达１２０００ｒ／ｍｉｎ以上。５．１７ 塑料封口机。５．１８ 微量移液器：量程０．５μＬ～１０００μＬ。５．１９ 电子天平：感量０．００１ｇ。５．２０ 水浴锅和电炉。５．２１ 普通冰箱（８℃～－２０℃）和低温冰箱（－２０℃～－４０℃）。６ 采样受精卵、３ｃｍ以下幼虾、仔虾、幼体采集整条对虾作为样品，成虾采集上皮、肝胰腺、肠或鳃作为样品。并根据ＧＢ／Ｔ１８０８８规定的数量取样，匀浆后取样品２５ｍｇ～１００ｍｇ置于１．５ｍＬ离心管中。７ 犠犛犇的诊断７．１ 犘犆犚检测７．１．１ 犇犖犃抽提除ＣＴＡＢ提取方法外，也可使用达到同等效果的商业提取试剂盒。先加入１５０μＬＣＴＡＢ溶液（见Ａ．１），用眼科剪剪碎后，用搅拌器将样品匀浆成糊状。加ＣＴＡＢ至９００μＬ。摇匀后，２５℃作用２ｈ。加６００μＬ抽提液１（见Ａ．２），用力混合３０ｓ，１４０００犵离心５ｍｉｎ，取上层水相。加６００μＬ抽提液２（见Ａ．３），用力混合３０ｓ，１４０００犵离心５ｍｉｎ，取上层水相。加不少于１．５倍体积的预冷无水乙醇，混匀后置于－２０℃５ｈ以上，以沉淀核酸。１４０００犵离心３０ｍｉｎ，小心弃上清，立即用滤纸充分吸干，３７℃干燥约２０ｍｉｎ，加１１μＬ水溶解后，作为ＰＣＲ模板。２犛犖／犜１１５１．２—２０１１７．１．２ 套式犘犆犚７．１．２．１ 第一次犘犆犚ＰＣＲ反应总体积１００μＬ，１０倍浓缩缓冲液（见Ａ．４）１０μＬ，氯化镁（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１０μＬ，ｄＮＴＰ２μＬ，犜犪狇酶（５Ｕ）１μＬ，引物１４６Ｆ１和１４６Ｒ１各２．５μＬ，６２μＬ灭菌双蒸水，然后加入１０μＬ待测样品ＤＮＡ作为模板。设立阳性对照和阴性对照，以水为模板作为空白对照。阳性对照为已知受ＷＳＶ感染且ＰＣＲ检测为阳性的对虾组织样品研磨上清液，提取核酸后取１０μＬ作为阳性对照模板。阴性对照为已知未受ＷＳＶ感染且ＰＣＲ检测为阴性的对虾组织样品研磨上清液，提取核酸后取１０μＬ作为阴性对照模板。将以上反应混合液混匀后稍离心，按以下反应程序进行扩增：９４℃４ｍｉｎ，１个循环；然后９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃２ｍｉｎ，３０个循环；再７２℃１０ｍｉｎ；最后４℃保温。７．１．２．２ 第二次犘犆犚第一次ＰＣＲ后，如结果为阳性，根据阳性的强弱作１０～１０００稀释，如结果为阴性，则不稀释，取１０μＬ作为第二次ＰＣＲ反应的模板。同时设立阳性对照和、阴性对照和空白对照。按７．１．２．１加入各反应组分及引物１４６Ｆ２和１４６Ｒ２各２．５μＬ，进行第二次ＰＣＲ。７．１．３ 琼脂糖电泳将６μＬ样品和２μＬ电泳样品缓冲液（见Ａ．７）混匀后加入凝胶孔中。５Ｖ／ｃｍ电泳约３０ｍｉｎ～６０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。７．１．４ 结果判定第一次ＰＣＲ后，阳性对照会出现一条１４４７ｂｐ的ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该核酸带。第二次ＰＣＲ后，阳性对照会出现一条９４１ｂｐ的ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该核酸带。待测样品第一次ＰＣＲ扩增后能出现１４４７ｂｐ的目的带，或经第二次ＰＣＲ后在９４１ｂｐ的位置上出现目的带。取ＰＣＲ扩增产物测序，同参考序列（参见附录Ｂ）进行比较，序列相似性在９８％以上的判为阳性，二次ＰＣＲ均无目的带或测序不对者的均判为阴性。７．２ 核酸探针斑点杂交技术检测犠犛犞７．２．１ 在样品中加入０．３ｍＬＳＥＭＰｔｒｉｓ研磨液，用研磨棒将样品充分研磨，１４０００犵离心２ｍｉｎ，取上清液备用。每次实验设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为已知受ＷＳＶ感染且核酸探针斑点杂交检测为阳性的对虾样品组织研磨上清液，阴性对照为已知未受ＷＳＶ感染且核酸探针斑点杂交检测为阴性的对虾样品组织研磨上清液。７．２．２ 按样品数量以及阳性对照、阴性对照数量，隔着衬纸在硝酸纤维素膜上用软铅笔划格，每样为５ｍｍ×５ｍｍ小格，沿框线将所需大小的硝酸纤维素膜剪下，一式两张。左上角剪角的一张为测试膜，左上角用软铅笔点标记的为对照膜。７．２．３ 将测试膜和对照膜飘浮于双蒸水表面，将其吸水后沉入水中１０ｍｉｎ，然后浸泡于２０×ＳＳＣ（见Ａ．８）中５ｍｉｎ，取出膜置于滤纸上晾干。７．２．４ 将７．２．１中的样品上清液（包括阴性对照和阳性对照）在１００℃水浴中煮沸１０ｍｉｎ，迅速置于冰水浴中２ｍｉｎ以上直到点样。稍离心，在晾干的测试膜和对照膜相应方格内点样，每个样品１μＬ，自然晾干后，将膜夹于两张滤纸中间，置于８０℃烘箱中烘烤２ｈ。７．２．５ 将测试膜和对照膜分别置于两个杂交袋中，加入预杂交液（见Ａ．１７），封口，在６５℃水浴中孵育２ｈ。３犛犖／犜１１５１．２—２０１１７．２．６ 将探针于１００℃水浴中煮沸１０ｍｉｎ，再迅速置于冰浴中２ｍｉｎ，剪开测试膜和对照膜杂交袋一角，加入探针（２０ｎｇ探针／ｍＬ预杂交液），封口。混匀袋中液体，６５℃水浴中孵育６ｈ～１６ｈ。７．２．７ 完全剪开杂交袋，取出测试膜和对照膜，室温下在平皿中用２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（见Ａ．１９）洗涤测试膜和对照膜两次，每次５ｍｉｎ，间歇摇晃。７．２．８ 取出测试膜和对照膜，分别置于两只新的杂交袋中，加入０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ，６５℃水浴１５ｍｉｎ，然后换杂交袋，再加入０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ，在６５℃水浴１５ｍｉｎ。７．２．９ 取出杂交袋中的测试膜和对照膜，室温下，在平皿中用１×缓冲液Ⅰ（见Ａ．１４）洗涤测试膜和对照膜两次，每次２ｍｉｎ，间歇摇晃。７．２．１０ 将测试膜和对照膜分别装于两只新的杂交袋中，加入缓冲液Ⅱ（见Ａ．１８），室温放置３０ｍｉｎ。７．２．１１ 剪开两个杂交袋一角，分别加入杂交袋内缓冲液Ⅱ１∶５０００体积的碱性磷酸酶标记的ＤＩＧ抗体（０．２μＬ／ｍＬ），封口，在振荡器上室温振荡３０ｍｉｎ。７．２．１２ 完全剪开两个杂交袋，取出测试膜和对照膜，在平皿中用１×缓冲液Ⅰ洗涤２次，每次１５ｍｉｎ。取出测试膜和对照膜，在平皿中用１×缓冲液Ⅲ（见Ａ．１６）洗涤２ｍｉｎ间歇摇晃。７．２．１３ 将测试膜和对照膜分别装于两只新的杂交袋中，加入显色液Ⅰ（见Ａ．２３）（０．２ｍＬ／ｃｍ２），封口，置于暗处显色１５ｍｉｎ～２ｈ。可短时间取出观察，勿搅动。７．２．１４ 在测试膜上阳性对照样品明显出现颜色，且测试膜和对照膜变色时，立即剪开杂交袋，取出膜，置于蒸馏水中１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，终止显色。将膜置于滤纸上晾干。７．２．１５ 对光观察，记录结果。７．２．１６ 结果判定：检测结果的判定要将测试膜与对照膜对照进行。测试膜上阳性对照样品的显色应为淡蓝褐色，阴性对照样品应为无色。参照膜上阳性对照和阴性对照均无色或膜上出现黄色、红色等颜色都不是病毒导致的非特异性显色结果。测试膜上斑点显蓝褐色，而对照膜对应斑点不显色或颜色比测试膜上浅得多时，该样品判断为阳性，该结果提示活虾和敏感宿主已被ＷＳＳＶ感染，或对虾产品及其他产品曾被ＷＳＳＶ感染；测试膜斑点不显色，该样品判断为阴性；测试膜与对照膜均有明显的颜色，则该样品存在明显的非特异性反应干扰，测试结果无法判断。结果可疑时，可补充组织病理学诊断或ＰＣＲ技术诊断或原位杂交技术诊断。７．３