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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５１．１—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２虾桃拉综合征检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊犺狉犻犿狆狋犪狌狉犪狊狔狀犱狉狅犿犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ１１５１系列标准共分为六部分：———虾桃拉综合征检疫技术规范；———对虾白斑病检疫技术规范；———斑节对虾杆状病毒（ＭＢＶ）诊断方法；———虾黄头病检疫技术规范；———对虾杆状病毒（ＢＰ）检验方法；———对虾白斑病毒斑点杂交和原位杂交检测操作规程。本部分为ＳＮ／Ｔ１１５１的第１部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本部分代替ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２《对虾Ｔａｕｒａ综合征病毒（ＴＳＶ）逆转录聚合酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）诊断方法》。本部分与ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２相比，主要技术内容变化如下：———整合和优化ＲＴＰＣＲ检测方法；———新增ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测方法。本部分修改采用世界动物卫生组织（ＯＩＥ）的《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）第２．２．４章，并对虾桃拉综合征ＲＴＰＣＲ检测方法进行了整合和优化。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本部分主要起草人：熊炜、张强、刘荭、郑腾、蒋静、李健、邱璐、王巧全、黄忠荣、胡永强。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５１．１—２００２。Ⅰ犛犖／犜１１５１．１—２０１１虾桃拉综合征检疫技术规范１ 范围ＳＮ／Ｔ１１５１的本部分规定了虾桃拉综合征ＲＴＰＣＲ和ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ检测的操作方法。本部分适用于虾桃拉综合征的流行病学调查、诊断、检疫和监测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样３ 概述桃拉综合征（Ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅ）是一种由桃拉综合征病毒（Ｔａｕｒａｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ，ＴＳＶ）感染而引起的严重威胁虾养殖的重要疫病，它是世界动物卫生组织（ＯＩＥ）规定的需上报的水生动物疫病。ＴＳＶ几乎能感染所有类型的养殖虾，如：南美白对虾、红额角对虾、褐对虾、白对虾、斑节对虾等，并感染孵化期的虾苗，其致死率高。ＴＳＶ感染有三个明显的阶段：急性期、过渡期和慢性期。在急性期，虾表皮上皮的组织切片中可以看到典型的病理损伤。而在过渡期和慢性期，却没有典型的病理损伤；虾发病死亡主要发生在急性期，急性感染后的幸存者在经过短暂的过渡期后，进入长时间的慢性感染期，处于慢性感染期的虾的淋巴器官终生持续有病毒存在，这些携带有病毒的虾可把病毒水平传播给其他易感虾。病毒学研究证实，ＴＳＶ是一种小的正二十面体无包膜病毒，直径３２ｎｍ，其基因组为单正链ＲＮＡ由１０２０５个核苷酸组成，含有两个大的开放阅读框（Ｏｐｅｎｒｅａｄｆｒａｍｅ，ＯＲＦ），ＯＲＦ１编码非结构蛋白如解旋酶、蛋白酶和ＲＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶等，ＯＲＦ２编码结构蛋白如衣壳蛋白ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３（其分子量大小分别为５５ｋＤａ、４０ｋＤａ、２４ｋＤａ）。４ 试剂和材料４．１ 犜犪狇酶及１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液：犜犪狇酶浓度为５Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．２ 逆转录酶及１０倍逆转录酶浓缩缓冲液：逆转录酶浓度为５０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．３ ＲＮＡ酶抑制剂：浓度为４０Ｕ／μＬ，－２０℃保存，避免反复冻融。４．４ ｄＮＴＰ：含ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．５ ＲＴＰＣＲ引物：引物浓度均为２０μｍｏｌ／Ｌ；引物有两对，可任选其一使用；引物９９９２Ｆ和９１９５Ｒ为ＯＩＥ推荐引物，其扩增基因片段的大小为２３１ｂｐ，引物ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增的基因片段大小为２９５ｂｐ，其序列如下：上游引物（９９９２Ｆ）：５’ＡＡＧＴＡＧＡＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＴ３’下游引物（９１９５Ｒ）：５’ＴＣＡＡＴＧＡＧＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ３’上游引物（ＴＳＶＦ）：５’ＡＴＴＧＡＡＴＡＣＴＴＡＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＣ３’下游引物（ＴＳＶＲ）：５’ＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＡＣＣＡＴＡＧＧＧＧＡＧ３’１犛犖／犜１１５１．１—２０１１４．６ ＲｅａｌｔｉｍｅＲＴＰＣＲ引物和探针：引物ＴＳＶ１００４Ｆ、ＴＳＶ１０７５Ｒ和探针ＴＳＶＰ１为ＯＩＥ推荐引物和探针，引物浓度为１５μｍｏｌ／Ｌ，探针浓度为５μｍｏｌ／Ｌ，其序列如下：上游引物（ＴＳＶ１００４Ｆ）：５’ＴＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＡＴＴ３’下游引物（ＴＳＶ１０７５Ｒ）：５’ＧＧＧＡＧＣＴＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＡＣＡＣＴＧＴ３’ＴａｑＭａｎ探针（ＴＳＶＰ１）：５’ＣＡＧＣＡＣＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＡＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣ３’，其５’端和３’端分别标记ＦＡＭ和ＴＡＭＲＡ。４．７ 随机引物：含有９个碱基的随机序列引物，浓度为５０μｍｏｌ／Ｌ，－２０℃保存。４．８ ＤＮＡ相对分子质量标准：适合检测分子量大小５０ｂｐ～５００ｂｐ间的ＤＮＡ片段，－２０℃保存。４．９ １０倍电泳上样缓冲液：４℃保存。４．１０ ＤＥＰＣ水：自配（见Ａ．１）或购买商品化试剂。４．１１ ＥＢ溶液：４℃保存（见Ａ．２）。４．１２ Ｔｒｉｚｏｌ试剂：４℃保存。４．１３ 三氯甲烷：常温保存。４．１４ 异丙醇：使用前预冷至－２０℃。４．１５ ７５％乙醇：用新开启的无水乙醇和ＤＥＰＣ水配制，使用前预冷至－２０℃。５ 仪器与设备５．１ ＰＣＲ仪：ＡＢＩ９７００或相同性能ＰＣＲ仪。５．２ 荧光ＰＣＲ检测仪：ＡＢＩ７７００、ＡＢＩ７５００或相同性能荧光ＰＣＲ检测仪。５．３ 高速台式冷冻离心机：可控温至４℃、离心速度可达１３０００犵以上。６ 临床症状的诊断虾桃拉综合征的病程有三个明显的阶段：急性期、过渡期和慢性期。在急性期和过渡期，虾表现出独特的外部症状，可据此对该疾病作出初步诊断。在急性期和过渡期，濒死虾体表出现大量的红色色素体，使感染虾全身呈暗淡的红色，而尾扇和游泳足呈明显的红色，用１０倍放大镜观察细小附肢（如末端尾肢或腹肢）的表皮上皮，可以看到病灶处的上皮坏死。濒死虾常漂浮在池塘边或水面，虾壳变软、空肠。急性感染的虾通常在蜕皮时死亡。在过渡期及后期，受感染虾可出现多处随机、不规则、黑色沉着的表皮病灶，这些黑色沉着的斑点是由血细胞累积而成的，该阶段虾可能不会出现表皮变软及红色素扩散，行为和摄食可能会保持正常。成功蜕皮后，病虾从过渡期发展到慢性期。在慢性期，虾几乎没有明显的体症，行为和摄食正常，但病毒在淋巴器官中保持持续感染，可能会终生带毒，可把病毒水平传播给其他易感虾。处于慢性期的虾对正常环境刺激的抵抗力要低于未被感染的虾（如：盐度突然降低）。７ 采样和样品前处理７．１ 采样出境检疫采样应在原产养殖场进行，进境检疫抽样应在进出境临时检疫隔离场（池）进行，采样数量根据ＧＢ／Ｔ１８０８８确定。采集送实验室检测的样品可以为稚虾、半成虾和成虾。采集的样品应保持鲜活，０℃～４℃冷藏保存。２犛犖／犜１１５１．１—２０１１７．２ 样品前处理７．２．１ 随机取５只～１０只新鲜的成虾作为取样标本，采集的部位包括：虾头部的鳃丝、肝胰腺、淋巴器官或血淋巴等组织（可部分或全部采集这些组织）。对于仔虾或稚虾，取整只虾或虾头作为样品。７．２．２ 取鳃丝时，用灭菌过的剪刀去除头部两侧的头胸甲，露出鳃丝，然后用剪刀剪取鳃丝。７．２．３ 取肝胰腺时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，露出内部的组织器官，其中深褐色的组织为肝胰腺，用剪刀剪取整块肝胰腺组织。７．２．４ 取淋巴器官时，用灭菌过的剪刀去除头部以后的腹部，并用剪刀纵向从背部剪开头胸甲和肌肉，暴露出内部的组织器官，在胃的腹侧、肝胰腺的后面，取出白色、呈二裂片状的淋巴器官。７．２．５ 取血淋巴时，先用１ｍＬ医用注射器吸取５００μＬ柠檬酸盐溶液（见Ａ．３），然后使虾腹部朝上，将针头水平插入正数第一和第二对游泳足之间，并一直插到最后一对胸部附器的凹陷处，然后缓慢吸取血淋巴。７．２．６ 将采集的样品，按每克样品加入１ｍＬＴＮ缓冲液（见Ａ．４），然后用玻璃匀浆器将样品匀浆。将匀浆液转移至１．５ｍＬ离心管中，４℃、２０００犵离心５ｍｉｎ，吸取上清液备用。７．３ 阳性对照样品和阴性对照样品的处理鲜活阳性对照样品和阴性对照样品的采样和样品前处理同待检样品，将鲜活样品中取出的组织样品分装后于－７０℃超低温冰箱保存备用。实验前将冷冻组织样品取出，然后按７．２．６进行样品前处理。８ 犚犖犃抽提及犮犇犖犃模板制备８．１ 犚犖犃抽提分别取１００μＬ待检样品匀浆上清液，以及ＴＳＶ阳性样品和阴性样品的上清液，加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ试剂，用枪头充分吹打２０次～３０次；加入２００μＬ三氯甲烷，涡旋振荡３０ｓ，混匀；１３０００犵离心１５ｍｉｎ；取上层水相，加５００μＬ异丙醇，上下颠倒数次混匀，－２０℃放置２０ｍｉｎ；１３０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，沉淀用１ｍＬＤＥＰＣ水配制的７５％乙醇清洗；８０００犵离心１０ｍｉｎ；弃上清液，沉淀室温干燥１０ｍｉｎ；加３０μＬＤＥＰＣ水溶解ＲＮＡ沉淀。ＲＮＡ溶液应尽快用于逆转录合成ｃＤＮＡ模板。商品化ＲＮＡ提取试剂盒同样适用于本标准的ＲＮＡ抽提。８．２ 犮犇犖犃模板制备取１８．５μＬＲＮＡ溶液，加１０倍逆转录酶浓缩缓冲液２．５μＬ、ｄＮＴＰ１μＬ、随机引物（或待扩增引物对的下游引物）１μＬ、ＲＮＡ酶抑制剂１μＬ、逆转录酶１μＬ。混匀后，置ＰＣＲ仪上经４２℃４０ｍｉｎ、７０℃１０ｍｉｎ，即得ｃＤＮＡ模板。如果暂时不进行检测可将ｃＤＮＡ模板保存至冰箱－２０℃。９ 犚犜犘犆犚检测及结果判定９．１ 犘犆犚检测体系配制在０．２ｍＬＰＣＲ薄壁管或八联管中，按每个样品１０倍犜犪狇酶浓缩缓冲液２．５μＬ、ｄＮＴＰ０．５μＬ、犜犪狇酶０．５μＬ、ｃＤＮＡ模板２μＬ、上游引物和下游引物（９９９２Ｆ和９１９５Ｒ，或ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ）各０．５μＬ、三蒸水１８．５μＬ配制ＰＣＲ检测体系。阳性和阴性对照样品的检测体系同样配制。３犛犖／犜１１５１．１—２０１１９．２ 犘犆犚检测的反应条件首先９４℃变性２ｍｉｎ，再９４℃３０ｓ、５８℃３０ｓ、７２℃３０ｓ进行４０个循环；然后７２℃５ｍｉｎ；最后２５℃５ｓ。９．３ 琼脂糖凝胶电泳用０．５倍ＴＢＥ电泳缓冲液配制浓度为１．５％的琼脂糖（含０．５μｇ／ｍＬＥＢ）凝胶平板，将该凝胶平板放入水平电泳槽，使缓冲液刚好没过胶面，电泳缓冲液工作浓度为０．５倍ＴＢＥ（见Ａ．５）。在９μＬＰＣＲ产物中加入１μＬ１０倍电泳上样缓冲液，然后加至凝胶平板的样品孔，同时设定ＤＮＡ相对分子质量标准对照。１００Ｖ电压电泳约３０ｍｉｎ，当溴酚蓝到达凝胶平板底部时停止电泳。用凝胶成像系统观察并拍摄凝胶图像。９．４ 检测结果判定９．４．１ ＴＳＶ阳性对照的ＰＣＲ产物应扩增出单一条带２３１ｂｐ（经引物对９９９２Ｆ和９１９５Ｒ扩增）或２９５ｂｐ（经引物对ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增）的ＤＮＡ片段，阴性对照不出现该大小ＤＮＡ片段，否则此次试验无效。９．４．２ 若检测样品的ＰＣＲ产物出现２３１ｂｐ（经引物对９９９２Ｆ和９１９５Ｒ扩增）或２９５ｂｐ（经引物对ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增）的ＤＮＡ片段，则判定桃拉综合征病毒核酸阳性。９．４．３ 若检测样品的ＰＣＲ产物不出现２３１ｂｐ（经引物对９９９２Ｆ和９１９５Ｒ扩增）或２９５ｂｐ（经引物对ＴＳＶＦ和ＴＳＶＲ扩增）的ＤＮＡ片段，则判定桃拉综合征病毒核酸阴性。１０ 犚犲犪犾狋犻犿犲犚犜犘犆犚检测及结果判定１０