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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１１５２—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２鲤春病毒血症检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狊狆狉犻狀犵狏犻狉犪犲犿犻犪狅犳犮犪狉狆２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准鲤春病毒血症检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１１５２—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张１ 字数２５千字２０１１年７月第一版 ２０１１年７月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２１２９ 定价１８．００元书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２《鲤春病毒血症病毒逆转录—聚合酶链式反应检测方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２相比，主要技术变化如下：———增加了荧光ＲＴＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法。参考了ＯＩＥ《水生动物诊断实验手册》第２．３．８章中推荐的鲤春病毒血症病毒的细胞培养分离、ＲＴＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张利峰、高隆英、史秀杰、王姝、段向英、张鹤晓、唐连飞、雷质文、江育林。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１１５２—２００２。Ⅰ犛犖／犜１１５２—２０１１鲤春病毒血症检疫技术规范１ 范围本标准规定了鲤春病毒血症（ＳＶＣ）的细胞培养分离病毒、ＲＴＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ和实时荧光ＲＴＰＣＲ检测技术。本标准适用于鲤春病毒血症的流行病学调查、诊断、检疫和监测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＳＮ／Ｔ１１９３ 基因检验实验室技术要求水生动物疾病诊断手册（ＯＩＥ，２００９年）３ 犛犞犆病毒的分离和鉴定３．１ 诊断原则本标准中的细胞分离病毒的方法可以用于从有临床症状的病鱼中分离病毒，也可以从无临床症状的病毒携带鱼中分离病毒；ＥＬＩＳＡ方法、ＲＴＰＣＴ方法和实时荧光ＲＴＰＣＴ方法则可以用于鉴定从细胞中分离到的病毒，或者有临床症状的病鱼组织中的病毒。其ＳＶＣ确诊病例的评价标准见第４章。３．２ 采样３．２．１ 采样部位鱼应是活的送到实验室。如是体长≤４ｃｍ的鱼苗取整条鱼，但如有卵黄囊则需除去；体长４ｃｍ～６ｃｍ的鱼苗取包括肾脏和脑在内的所有内脏；体长≥６ｃｍ的鱼则取肝、脑、脾、肾。成熟雌鱼还需在产卵期采集一次卵巢液。３．２．２ 有临床症状的鱼挑选１０条有代表性的临床症状的病鱼或者濒死鱼。３．２．３ 无临床症状的鱼随机采集不少于１５０尾鱼样品。３．２．４ 用于宣布犛犞犆无病区的监测时的采样技术要求３．２．４．１ 为获取鱼群健康状态的采样要求在２年内每年对该养殖场检查两次。检查时间应选在一年中最易观察到临床症状并能分离到病原体的温度和季节。每次采集１５０尾鱼，或者在有怀卵鱼的情况下，两次检查中要有一次在指定的养殖单１犛犖／犜１１５２—２０１１位的亲鱼中取１５０份卵巢液样品。３．２．４．２ 为保持鱼群健康状态的采样要求一旦生产单位包括池塘的鱼及其设施经实验室检测两年，无ＳＶＣＶ，也无任何可疑临床症状之后，每年还应继续检疫两次。每次采集的样品可以减少到６０尾，并尽可能包括怀卵鱼。但在检疫中发现有濒死鱼时应采样做进一步的实验室检查。３．３ 样品的合并对于病毒分离，将三到五尾鱼的组织脏器混合为一份样品。对于ＲＴＰＣＲ、实时荧光ＲＴＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ检测，如果是病鱼组织，应每尾病鱼测定。３．４ 设备和材料３．４．１ 设备倒置显微镜、低温培养箱、－２０℃普通冰箱、－８０℃超低温冰箱、组织研磨器、冷冻离心机、生物安全柜、ＰＣＲ仪、实时荧光ＰＣＲ仪、电泳仪、微波炉、微量移液器、凝胶成像仪或紫外观察灯、高压灭菌锅、水浴锅、制冰机、磁力搅拌器、培养液过滤器、酶标仪和洗板机。３．４．２ 材料３．４．２．１ 水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。用于ＰＣＲ（包括核酸抽提）时所用的水要用ＤＥＰＣ处理以除掉ＲＮＡ酶。３．４．２．２ ＳＶＣ病毒标准株。３．４．２．３ 鲤鱼上皮瘤细胞（ＥＰＣ）或草鱼性腺细胞（ＣＯ）或胖头鱼肌肉细胞（ＦＨＭ）。３．４．２．４ 细胞生长液：含１０％胎牛血清的１９９细胞培养液（含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的１９９培养基配制）。３．４．２．５ 细胞维持液：含２％胎牛血清的１９９细胞培养液（含Ｅａｒｌｅ’ｓ平衡盐的１９９培养基配制）。３．４．２．６ 细胞消化液（配方参见附录Ａ）。３．４．２．７ ＲＮＡ提取液或其他ＲＮＡ抽提试剂（配方参见附录Ａ）。３．４．２．８ ＲＴＰＣＲｂｅａｄ或其他逆转录酶。３．４．２．９ 三氯甲烷（分析纯）。３．４．２．１０ 异丙醇（分析纯）。３．４．２．１１ 无水乙醇（分析纯）。３．４．２．１２ ７５％乙醇。３．４．２．１３ ＰＣＲ缓冲液和ＲＴＰＣＲ缓冲液。３．４．２．１４ 硫酸镁（ＭｇＳＯ４）。３．４．２．１５ ｄＮＴＰ。３．４．２．１６ ＤＮＡ聚合酶。３．４．２．１７ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００。３．４．２．１８ 核酸染料。３．４．２．１９ 琼脂糖。３．４．２．２０ ＴＢＥ电泳缓冲液（配方参见附录Ａ）。３．４．２．２１ 上样缓冲液（配方参见附录Ａ）。３．４．２．２２ 引物和探针：ＲＴＰＣＲ检测按照《水生动物疾病诊断手册》的设计，选用ＳＶＣＶ的糖蛋白基因作为ＲＴＰＣＲ的模板，用了２对引物：ＳＶＣＶＦ１（５’ＴＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＡＧＣＴＣＡＲ２犛犖／犜１１５２—２０１１ＲＴＣ３’）和ＳＶＣＲ２（５’ＡＧＡＴＧＧＴＡＴＧＧＡＣＣＣＣＡＡＴＡＣＡＴＨＡＣＮＣＡＹ３’）扩增该基因中的７１４ｂｐ片段，而ＳＶＣＶＦ１和ＳＶＣＶＲ４（５’ＣＴＧＧＧＧＴＴＴＣＣＮＣＣＴＣＡＡＡＧＹＴＧＹ３’）则从该片段中再扩增６０６ｂｐ片段。实时荧光ＲＴＰＣＲ检测病毒的引物探针为自行设计，上游引物序列（５’ＡＴＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＴＧＣＡＴＣＡＧ３’），下游引物序列（５’ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＣＴＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＡＡ３’），探针序列和荧光标记（５’（ＦＡＭ）ＴＣＣＣＣＣＴＣＡＡＡＧＴＴＧＣＧＧＡＴＧＧ（ＴＡＭＲＡ）３’）。扩增ＳＶＣＶＧ蛋白中的片段位置参见附录Ｂ。３．４．２．２３ ｐＨ９．５，０．０２ｍｏｌ／Ｌ的碳酸缓冲液。３．４．２．２４ 抗ＳＶＣＶ的特异性免疫球蛋白。３．４．２．２５ 封闭液。３．４．２．２６ ２％的无离子洗涤剂。３．４．２．２７ 酶标抗ＳＶＣＶ的单克隆抗体或多克隆抗体。３．５ 犛犞犆病毒的分离３．５．１ 样品处理ＳＶＣＶ的分离应在２５℃以下进行，先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，再按１∶１０的最终稀释度重悬于１９９细胞培养液中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则应将样品匀浆后再悬浮于含有１０００ＩＵ／ｍＬ青霉素和８００ｎｇ／ｍＬ链霉素的１９９细胞培养液中，于１５℃下孵育２ｈ～４ｈ或４℃下孵育６ｈ～２４ｈ。７０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染。不必匀浆但需稀释２倍以上，用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。３．５．２ 病毒分离对１∶１０的组织匀浆上清液再用１９９细胞培养液作两次１０倍稀释，然后将这１∶１０、１∶１００和１∶１０００３个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约２４ｈ的ＥＰＣ、ＣＯ或者ＦＨＭ长到８０％细胞单层中，９６孔板每孔的细胞单层接种１００μＬ稀释液。１５℃～２０℃吸附０．５ｈ～１ｈ后，加入细胞维持液。置于１８℃±２℃培养。试验中要有２孔阳性对照（接种ＳＶＣＶ标准株），和空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，７ｄ内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（ＣＰＥ），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有ＣＰＥ出现，则在培养７ｄ后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以７０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心１５ｍｉｎ，收集上清液，将上清液接种到新鲜细胞单层，培养７ｄ。每天用４０倍～１００倍倒置显微镜检查。如果样品接种细胞盲传两代后仍无ＣＰＥ出现，则结果判为阴性。如果有ＣＰＥ出现，则要用其他方法进行鉴定是否是由ＳＶＣＶ引起。如果阳性对照也未出现ＣＰＥ，则应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离。３．６ 犛犞犆病毒犚犜犘犆犚３．６．１ 实验室的设置与管理实验室的设置与管理见ＳＮ／Ｔ１１９３的要求。３．６．２ 样品犚犖犃的提取可参见附录Ａ。３．６．３ 逆转录在２０μＬ反应体系中，添加以下反应成分至相应浓度：１×ＭＭＬＶＲＴ缓冲液（５０ｍｍｏｌＴｒｉｓ，３犛犖／犜１１５２—２０１１ｐＨ８．３，７５ｍｍｏｌＫＣｌ，１０ｍｍｏｌＤＴＴ，３ｍｍｏｌＭｇＣｌ２）、１ｍｍｏｌｄＮＴＰ、１００ｐｍｏｌＳＶＣＶＲ２引物、２０ＵＭＭＬＶ逆转录酶和２μＬ模板，置于３７℃反应１ｈ。也可采用一步法，在一个反应体系完成逆转录和ＰＣＲ。３．６．４ 犘犆犚扩增犇犖犃在５０μＬ反应体系中，添加以下反应成分至相应浓度：１×ＰＣＲ缓冲液（５０ｍｍｏｌＫＣｌ，１０ｍｍｏｌＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ９．０，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）、２．５ｍｍｏｌＭｇＣｌ２、２００μｍｏｌｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌＳＶＣＶＲ２和ＳＶＣＶＦ１引物、１．２５Ｕ犜犪狇酶、２．５μＬ逆转录混合液。加矿物油封液后放置于ＰＣＲ仪。９５℃／１ｍｉｎ→５５℃／１ｍｉｎ→７２℃／１ｍｉｎ；３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，最后４℃保温。３．６．５ 琼脂糖电泳用电泳缓冲液制备１．０％的琼脂糖凝胶平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将６μＬ样品ＰＣＲ扩增产物和２μＬ电泳上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时设立ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００作对照。５Ｖ／ｃｍ电泳约０．５ｈ，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下或凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性ＤＮＡ电泳带，拍摄并记录。３．６．６ 嵌套式犘犆犚如果ＰＣＲ后产物电泳时看不到ＤＮＡ带，取５μＬ产物做模板；如果ＰＣＲ后产物电泳时能看到ＤＮＡ带，只是要求进一步核实，则需将产物按１∶１０００稀释后，取５μＬ产物做模板。然后在５０μＬ反应体系中，添加以下反应成分至相应浓度：１×ＰＣＲ缓冲液（５０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ９．０，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００）、２．５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２、２００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｓ、５０ｐｍｏｌＳＶＣＶＲ４和ＳＶＣＶＦ１引物、１．２５Ｕ犜犪狇酶、２．５μＬ第一次ＰＣＲ的扩增产物。如果ＰＣＲ仪没有热盖，应加矿物油封液后放置于ＰＣＲ仪。９５℃／１ｍｉｎ→５５℃／１ｍｉｎ→７２℃／１ｍｉｎ；３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ，最后４℃保温。３．６．７ 设立对照３．６．７．１ 在３．６．２样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。３．６．７．２ 取含有已知ＳＶＣ病毒标准株的细胞悬液或含有病毒目的片段的非感染性体外转录ＲＮＡ作为阳性对照。３．６．７．３ 取正常的细胞悬液作为阴性对照。３．６．７．４ 取等体积的水代替