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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２７２９—２０１０马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法犇犲狋犲犮狋犻狅狀犪狀犱犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊（犠犪犾犾狉．）犎狌犵犺犲狊２０１０１１０１发布２０１１０５０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘伟、刘会梅、封立平、王秀芬、姜丽、王有福、董薇。Ⅰ犛犖／犜２７２９—２０１０马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了进境马铃薯块茎以及携带土壤中马铃薯炭疽病菌的检疫和鉴定方法。本标准适用于马铃薯块茎以及携带土壤中马铃薯炭疽病菌的检疫和鉴定。２ 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。２．１块茎 狋狌犫犲狉地下茎末端肥大成块状，适应储藏和越冬的变态茎。２．２分生孢子盘 犪犮犲狉狏狌犾狌狊由基质表面突起的盘状菌丝块结构，其上生出密集的短分生孢子梗，分生孢子梗之间常生有刚毛。２．３刚毛 狊犲狋犪犲一种较坚硬的毛状物，常壁厚，且颜色较暗。２．４菌核 狊犮犾犲狉狅狋犻狌犿菌核是由菌丝紧密交织而成的休眠体，内层是疏丝组织，外层是拟薄壁组织，表皮细胞壁厚、色深、较坚硬。菌核的功能主要是抵抗不良环境。但当条件适宜时，菌核能萌发产生新的营养菌丝或从上面形成新的繁殖体。２．５附着孢 犪狆狆狉犲狊狊狅狉犻狌犿植物病原真菌孢子萌发形成的芽管或菌丝顶端的膨大部分，可以牢固地附着在寄主体表面，其下方产生侵入钉穿透寄主角质层和表层细胞壁。３ 原理３．１ 马铃薯炭疽病菌的分类地位马铃薯炭疽病菌犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犮狅犮犮狅犱犲狊（Ｗａｌｌｒ．）Ｈｕｇｈｅｓ的中文名称为“墨色刺盘孢”。犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿为子囊菌、小丛赤壳属（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）的无性型。根据《ＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＦｕｎｇｉ》第９版，犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿分类地位为真菌界，有丝分裂孢真菌Ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃｆｕｎｇｉ。３．２ 检疫和鉴定原理马铃薯块茎被马铃薯炭疽病菌侵染后出现圆形的病斑，在马铃薯块茎、匍匐茎、根、地上及地下茎变色的部位都能形成大量黑色的小菌核。本标准以该病菌在马铃薯块茎上的主要危害症状、形态学特征以及ＰＣＲ反应特性为鉴定马铃薯炭疽病菌的主要依据。马铃薯炭疽病菌的形态特征及背景资料参见１犛犖／犜２７２９—２０１０附录Ａ。４ 仪器设备和用具４．１ 仪器设备超净工作台、高压灭菌锅、光照培养箱、体式显微镜、生物显微镜、冰箱、ＰＣＲ仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、台式小型离心机、Ｍｉｎｉ离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外反射透射仪、低温冰箱（－８０℃）、凝胶成像系统、研磨珠均质器、空层析柱、天平（感量０．００１ｇ）。４．２ 用具白瓷盘和尖头镊子、可调微量加样器、液氮罐、ＰＣＲ反应管、研钵、玻璃珠、螺帽管、培养皿、离心管、酒精灯、三角瓶（５０ｍＬ，１００ｍＬ）、量筒（５００ｍＬ）、载玻片（２５．３ｍｍ×７６．２ｍｍ）、盖玻片（１８ｍｍ×１８ｍｍ）、手术刀、手术剪、镊子、ｐＨ计、塑料袋、离心管等。５ 试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂：次氯酸钠、吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、三氨基甲烷、ＥＤＴＡ、酚、异戊醇、氯化钾、４种脱氧核苷三磷酸（ｄＮＴＰ）、溴化乙锭（ＥＢ）、ＲＮａｓｅ酶、蛋白酶Ｋ、ＢＳＡ、ＰＶＰＰ、ＰＶＰ、异丙醇、三氯甲烷、饱和酚、巯基乙醇、山梨糖、溴酚蓝、硫酸氨、ＣＴＡＢ、ＢｉｏｌａｓｅＤｉａｍｏｎｄ、ＳＤＳ、葡萄糖凝胶ＳｅｐｈａｄｅｘＧ７５、多聚半乳糖醛酸ＰＧＡ、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、山梨糖。抗菌剂：五氯硝基苯ＰＣＮＢ、苯菌灵、硫酸链霉素、四环素盐酸、氯霉素、红霉素、硫酸新霉素、扑海因、氯苯密醇、乙烯菌核利。１×ＴＢＥ缓冲液、上样缓冲液、ＴＥ缓冲液、菌丝体ＤＮＡ提取缓冲液、均质缓冲液、土壤和块茎ＤＮＡ提取缓冲液ＳＰＣＢ、１×ＰＣＲ反应缓冲液。６ 现场检疫６．１ 抽样６．１．１ 抽样方法以批为抽样单位，无批号的以品种为抽样单位。每份样品的抽样点不少于５个，随机抽取。单位包装只能有一个抽样点。６．１．２ 抽样数量５００粒以下取一份；５０１粒～２０００粒取两份；２００１粒～５０００粒取三份；５００１粒～１００００粒取四份；１０００１粒以上，每增加１００００粒增取一份，不足１００００粒的余量，计取一份。每份样品２０粒块茎。６．２ 查验按进口马铃薯块茎总件数的５％～２０％随机抽检，最低抽检数量不少于１０件，且不少于１０００粒。根据马铃薯炭疽病在马铃薯块茎上的特有症状特点进行视觉检验（必要时使用放大镜观察），在光线充足处进行。将有典型病症以及有怀疑症状的块茎用塑料袋装好，加贴标识后送实验室进行进一步的分离和病原鉴定，并做好现场检疫记录。２犛犖／犜２７２９—２０１０６．３ 土壤样品的收集如果发现马铃薯块茎表面携带土壤，则用毛刷轻轻刷下粘在块茎表面以及芽眼上的土壤；如果携带土壤较少，则用水洗并收集土壤；注意收集散落在包装内外的土壤。收集的土壤用塑料袋装好并加贴标识带回实验室检测。７ 实验室检验７．１ 土壤中病原菌分离收集到的土壤随机取１０ｇ置于１００ｍＬ灭菌水中充分振荡，微量移液器取０．５ｍＬ后玻棒均匀涂布在半选择性培养基或选择性培养基上（见附录Ｂ），１８℃～２４℃培养１４ｄ后在体视显微镜下观察。发现菌落后，将菌落的边缘或产生的分生孢子转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（见附录Ｂ）上继续培养，产孢后进行形态鉴定。７．２ 块茎上病菌分离７．２．１ 将现场抽取的马铃薯块茎样品混匀，从中随机抽取１００个块茎进行检验。逐个检查块茎表面是否有典型的病斑或带有黑色的小菌核，按７．２．２、７．２．３及７．４进行分离鉴定。７．２．２ 块茎表面病斑的分离：将表面产生典型病斑以及有怀疑症状的块茎，在流水下冲洗去除表面的杂物后，切下病健交界处的小块组织（３ｍｍ厚，直径１ｃｍ），表面用１％的次氯酸钠消毒３ｍｉｎ～５ｍｉｎ，无菌水冲洗２次～３次，置于ＰＤＡ培养基上，２１℃～２５℃下分离培养，１０ｄ～１４ｄ后体视显微镜下观察。出现菌落后，将菌落的边缘或分生孢子转移到ＰＤＡ上继续纯化培养，产孢后进行形态鉴定或利用菌丝体直接进行ＰＣＲ检测（见附录Ｃ．１）。７．２．３ 块茎表面菌核的分离：对表面发现黑色小菌核的块茎，将表面用１％的次氯酸钠消毒１０ｍｉｎ，无菌水冲洗２次～３次，取下小菌核置于ＰＤＡ培养基上，黑暗中２７℃下培养７ｄ促进产孢。７．３ 培养物菌丝体的犘犆犚检测见附录Ｃ．１。７．４ 块茎以及土壤中病原菌的巢式犘犆犚检测见附录Ｃ．２。８ 鉴定特征８．１ 马铃薯块茎上的特征马铃薯块茎上形成银色至褐色的病斑，边缘界限不明显，上面常具球形或不规则的黑色菌核，菌核直径约１００μｍ～０．５ｍｍ。分生孢子盘黑褐色，圆形或长形，直径２００μｍ～３５０μｍ。刚毛聚生在分生孢子盘中央或散生于孢子盘中，刚毛黑褐色，顶端较尖，１隔～３隔，（８０μｍ～３５０μｍ）×（４μｍ～６μｍ）。分生孢子梗圆筒形，偶有隔膜，无色至淡褐色，直；分生孢子圆柱形，下尖上圆，单胞，无色，直，有时稍弯，（１７．５μｍ～２２μｍ）×（３．０μｍ～７．５μｍ）。８．２ 培养特征马铃薯炭疽病菌在ＰＤＡ培养基上，菌落平展，白色，背面深褐色。菌落中常密布黑色的小菌核，菌核３犛犖／犜２７２９—２０１０球形，直径１００μｍ～５００μｍ，菌核呈同心环状排列，菌核上产生分生孢子盘，分生孢子盘上产生大量的分生孢子和刚毛。刚毛变化很大，长８０μｍ～３５０μｍ，具分隔，顶部很尖。分生孢子自由生长或呈木栅栏状，分生孢子半透明，圆柱形或一端变细的棍棒形，（１７．５μｍ～２２μｍ）×（３．０μｍ～７．５μｍ），含１个～３个油球。常见附着孢，长棍棒状，有时形状不规则，边缘锯齿状，中度褐色，（１１μｍ～１６．５μｍ）×（６μｍ～９μｍ），有时会形成复杂的结构。８．３ 犘犆犚检测马铃薯炭疽病菌经菌丝体的ＰＣＲ检测，应在３４９ｂｐ处有特异性条带（见附录Ｃ．１）；经块茎和土壤中病原菌巢式ＰＣＲ检测，在３４９ｂｐ处有特异性条带（见附录Ｃ．２）。９ 结果判定９．１ 病菌在马铃薯块茎上引起８．１特征，并经培养鉴定符合８．２的培养特征，可以判定为马铃薯炭疽病菌。９．２ 利用７．２．２培养所获得的菌丝体经ＰＣＲ检测，在３４９ｂｐ处有特异性条带，阴性对照无条带产生，阳性对照亦产生３４９ｂｐ条带的，可判定该病菌为马铃薯炭疽病菌。９．３ 块茎、土壤中病原菌经巢式ＰＣＲ检测后，在３４９ｂｐ处有特异性条带，阴性对照无条带产生，阳性对照亦产生３４９ｂｐ条带的，可判定该病菌为马铃薯炭疽病菌。１０ 标本和样品保存分离并鉴定为马铃薯炭疽病菌的菌株要转移到斜面上，连同被马铃薯炭疽病菌侵染的块茎及土壤样品于４℃冰箱中保存至少６个月，以备复检、谈判和仲裁，保存期满后进行灭活处理。１１ 复核由国家质量监督检验检疫总局指定单位和人员对检测结果进行复核，主要考核实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。４犛犖／犜２７２９—２０１０附 录 犃（资料性附录）马铃薯炭疽病菌的形态特征及背景资料犃．１ 马铃薯炭疽病菌的形态特征图犃．１ 马铃薯炭疽病菌的分生孢子（犫犪狉＝１０μ犿）［仿犅．犆．犛狌狋狋狅狀（１９８０）］图犃．２ 马铃薯炭疽病菌的附着孢（犫犪狉＝１０μ犿）［仿犅．犆．犛狌狋狋狅狀（１９８０）］犃．２ 马铃薯炭疽病菌背景资料犃．２．１ 马铃薯炭疽病菌分布非洲：埃塞俄比亚、肯尼亚、摩洛哥、尼日利亚、津巴布韦、南非、苏丹、坦桑尼亚、乌干达。亚洲：阿富汗、缅甸、中国（吉林和山东）、印度、印度尼西亚、伊朗、以色列、约旦、日本、朝鲜、黎巴嫩、马来西亚、巴基斯坦、叙利亚、土耳其、高加索（前苏联）。大洋洲和太平洋岛屿：澳大利亚、新西兰。欧洲：奥地利、比利时、英国、北爱尔兰、保加利亚、塞浦路斯、捷克斯洛伐克、丹麦、法国、德国、希腊、匈牙利、爱尔兰、意大利、荷兰、波兰、葡萄牙、罗马尼亚、西班牙、瑞士。北美洲：百慕大、加拿大、美国。南非：巴西、秘鲁、委内瑞拉。５犛犖／犜２７２９—２０１０中美洲和西印度群岛：巴巴多斯岛、牙买加。犃．２．２ 寄主马铃薯炭疽病菌的寄主较广，目前已有报道的涉及１３个科的３６种，主要有：马铃薯、西红柿、洋葱、草莓、红辣椒、南瓜、茄子、冬樱桃、胡椒、甘蓝、水芹、莴苣、菊花、白芥菜、灯笼果、珊瑚豆、曼陀罗等。６犛犖／犜２７２９—２０１０附 录 犅（规范性附录）培养基配方犅．１ 基础培养基犅．１．１ 犘犇犃培养基（或选用市售犘犇犃培养基）马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。将马铃薯去皮，洗净，称取２００ｇ，切成小块，放入１０００ｍＬ水中煮沸２０ｍｉｎ，用双层纱布过滤，得到马铃薯汁，补足水分，再加入２０ｇ葡萄糖和琼脂不断搅拌至琼脂完全溶化，补充水量至１０００ｍＬ，再加热至沸腾，灭菌后使用。犅．１．２ 犘犇培养基马铃薯２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ。将马铃薯去皮，洗净，称取２００ｇ，切成小块，放入１０００ｍＬ水中煮沸２０ｍｉｎ，用双层纱布过滤，得到马铃薯汁，补足水分，再加入２０ｇ葡萄糖不断搅拌，补充水量至１０００ｍＬ再加热至沸腾，灭菌后使用。犅．２ 选择性培养基１０ｇ多聚半乳糖醛酸，１．５ｇ磷酸二氢钾，４ｇ磷酸氢二钾，２５ｍＬ土壤浸出液加入１０００ｍＬ水中，加热至沸腾后加入１７ｇ琼脂不断搅拌至完全溶化，灭菌前调节ｐＨ５．０。使用前，添加以下抗菌剂：０．１ｇ五氯硝基苯（ＰＣＮＢ），０．１ｇ苯菌灵，０．１ｇ硫酸链霉素，０．１ｇ盐酸四环素，０．１ｇ氯霉素，基础培养基灭菌冷却至５０℃左右时加入。土壤浸出液的制作方法：５００ｇ田园土加５００ｍＬ蒸馏水，充分搅拌后静置２４ｈ，上清液用双层普通滤纸过滤，有条件的可以用孔径０．２２μｍ的滤膜过滤２次除菌，或直接置于４℃冰箱中保存备用。犅．３ 半选择性