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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!!!!#$#出血性败血症检疫技术规范$%&’&()*(+,’-)-.-/0-’1&+2-’’1&3*.4+,)*.&+2*&!#$#5$$5#$发布!#$$5#%5#$实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准采用重新起草法，修改采用国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００９版），第２．４．１２“出血性败血症”部分。主要的技术性差异如下：———对标准文本进行了调整；———对血清型鉴定方法进行细化和完善。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：宋阳威、郑志高、张常印、廉慧锋、李东明、易海华、王凯明、唐泰山、吴亚力、张敬友。Ⅰ犛犖／犜２７２２—２０１０出血性败血症检疫技术规范１ 范围本标准规定了出血性败血症的病原鉴定和血清型鉴定方法的技术要求。本标准适用于进出境牛出血性败血症的检疫和诊断。２ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＡＧＩＤ （ａｇａｒｇｅｌｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎＴｅｓｔ）：琼脂免疫扩散试验ＣＩＥＰ （ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＴｅｓｔ）：对流免疫电泳试验ＨＳ （ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）：出血性败血症ＩＨＡ （ｉｎｄｉｒｅｃｔｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎＴｅｓｔ）：间接血凝试验３ 疾病概述出血性败血症病原学、流行病学、症状和病理变化、检疫及诊断参见附录Ａ。４ 检疫方法４．１ 细菌分离和鉴定４．１．１ 材料和试剂４．１．１．１ 细菌分离培养基：见附录Ｂ。４．１．１．２ 细菌生化鉴定培养基和试剂：见附录Ｂ。４．１．２ 样品的采集４．１．２．１ 采集动物死后数小时内的血液或心脏拭子。４．１．２．２ 如果动物死亡时间较长，可取无组织长骨。４．１．３ 样品的培养４．１．３．１ 血液样品或２ｍＬ～３ｍＬ灭菌生理盐水拭子洗液接种于血琼脂平板，麦康凯琼脂平板，改良马丁氏琼脂平板，置３７℃培养２４ｈ。４．１．３．２ 无组织长骨表面用酒精搽拭后劈开，无菌抽取骨髓接种于血琼脂平板，麦康凯琼脂平板，改良马丁氏琼脂平板，置３７℃培养２４ｈ。４．１．４ 细菌鉴定４．１．４．１ 培养特性新分离的出血性败血症多杀性巴氏杆菌（ＨＳ多杀性巴氏杆菌）在血琼脂上３７℃培养２４ｈ后，能形１犛犖／犜２７２２—２０１０成光滑的、有灰色光泽的半透明菌落，直径约１ｍｍ。在改良马丁氏琼脂上划线分离可获得纯培养物。老龄菌特别是在那些无血培养基上的，形成小菌落。在麦康凯琼脂培养基上不生长。４．１．４．２ 细菌形态特征血液涂片用革兰氏、亚甲蓝或利什曼法染色可见革兰氏阴性、短的、卵圆形、两极着染的球杆菌。有时还有一定程度的多形性，尤其是在老龄培养物中，呈现不同长度的杆状。用亚甲蓝或利什曼法染色时，两极着色更明显。４．１．４．３ 生化特性ＨＳ多杀性巴氏杆菌生化特性见表１。表１ 犎犛多杀性巴氏杆菌生化特性氧化酶过氧化氢酶吲哚硝酸盐硫化氢尿素酶柠檬酸盐明胶产酸葡萄糖蔗糖山梨醇阿拉伯糖木糖麦芽糖水杨苷乳糖＋＋＋＋－－－－＋＋（＋）＋／－＋／－＋／－（－）（－） 注：＋：阳性反应；（＋）：多数菌株；＋／－：部分菌株；（－）：少数菌株；－：阴性反应。４．１．５ 结果的判定与解释细菌培养特性、形态特征和生化特性符合４．１．４时，则判定为ＨＳ多杀性巴氏杆菌分离阳性。４．２ 血清型鉴定４．２．１ 快速玻片凝集试验（荚膜分型）４．２．１．１ 材料和试剂４．２．１．１．１ 多杀性巴氏杆菌Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ分型血清。４．２．１．１．２ 参考菌株（６：Ｂ和６：Ｅ）。４．２．１．１．３ 生理盐水。４．２．１．１．４ 待测荚膜抗原型ＨＳ多杀性巴氏杆菌。４．２．１．２ 操作方法４．２．１．２．１ 将玻璃板划成每格３ｃｍ×３ｃｍ的区域，每一格下留少许位置，用于填写样品编号。４．２．１．２．２ 上述各格标上待检样品编号，参考菌株血清型，每格加２５μＬ无菌生理盐水。４．２．１．２．３ 用接种环挑取细菌纯培养物于玻片上的生理盐水中混匀，加一滴分型血清，混匀并缓慢加热玻片。４．２．１．３ 结果判定４．２．１．３．１ 参考菌株的对照试验出现絮状凝集，则试验成立，可以判定。否则，本次试验无效。４．２．１．３．２ 在３０ｓ内出现粗的絮状凝集者判为阳性。老龄培养物需要较长时间出现细的粒状凝集。２犛犖／犜２７２２—２０１０４．２．２ 间接血凝试验（荚膜分型）４．２．２．１ 材料和试剂４．２．２．１．１ 多杀性巴氏杆菌Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ分型血清。４．２．２．１．２ 参考菌株（６：Ｂ和６：Ｅ）１％荚膜抗原致敏红细胞（以下称阳性致敏红细胞）和阴性致敏红细胞。４．２．２．１．３ 待测ＨＳ多杀性巴氏杆菌１％荚膜抗原致敏红细胞（以下称１％致敏红细胞）：见附录Ｃ。４．２．２．１．４ １％新鲜红细胞：见附录Ｃ。４．２．２．１．５ ９６孔Ｖ型微量反应板。４．２．２．１．６ ０．３％福尔马林生理盐水。４．２．２．２ 操作方法４．２．２．２．１ 将多杀性巴氏杆菌Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ分型血清分别倍比稀释至第６孔，每次检测需设对照试验组，包括阳性对照、阴性对照和空白对照试验。试验操作程序见表２。表２ 犎犛多杀性巴氏杆菌间接血凝试验程序及结果判定举例４．２．２．２．２ 第一孔加入７２μＬ０．３％福尔马林生理盐水，后面５孔各加４０μＬ。４．２．２．２．３ 将８μＬ血清加入第一孔，依次作倍比稀释至第６孔，最后弃去４０μＬ。４．２．２．２．４ 每孔中分别加４０μＬ致敏红细胞。４．２．２．２．５ 置反应板于微量振荡器上轻微振荡１ｍｉｎ，混匀。４．２．２．２．６ 将反应板加盖，置室温下感作２ｈ～１８ｈ后观察结果。３犛犖／犜２７２２—２０１０４．２．２．３ 结果判定４．２．２．３．１ 凝集程度的判别标准＋＋＋＋：红细胞全部凝集，形成均一的膜，布满整个孔底。 ＋＋＋：红细胞在孔底形成一层薄膜，但面积比前者小。 ＋＋：红细胞在孔底形成薄层，边缘松散或呈锯齿状。 ＋：红细胞在孔底形成小圆点，周围有稀疏散在的少量凝集。 －：红细胞完全沉于孔底，形成小的光滑圆盘点。４．２．２．３．２ 红细胞凝集效价被检抗原产生“＋＋”红细胞凝集现象的最高稀释倍数为红细胞凝集效价。４．２．２．３．３ 有效性判定阳性对照：应为（＋＋＋＋）。阴性对照：应为（－）。空白对照：应无自凝现象，即（－）。对照试验成立，可以判定。否则，本次试验无效。４．２．２．３．４ 结果判定被检血清检测结果按以下标准判断：———红细胞凝集效价为１∶１６０及以上，判为阳性；———红细胞凝集效价为１∶４０及以下，判为阴性；———红细胞凝集效价介于１∶４０与１∶１６０之间的，判为可疑。被检血清如出现可疑结果的，应作复检，复检结果仍为可疑的，判为阳性。４．２．３ 平板凝集试验（菌体分型）４．２．３．１ 材料和试剂４．２．３．１．１ 待检ＨＳ多杀性巴氏杆菌菌体抗原：见附录Ｃ。４．２．３．１．２ 标准ＨＳ多杀性巴氏杆菌菌体抗原（参考菌株６：Ｂ和６：Ｅ）和标准阴性菌体抗原。４．２．３．１．３ 标准ＨＳ多杀性巴氏杆菌（参考菌株６：Ｂ和６：Ｅ）的抗菌体抗原血清。４．２．３．２ 操作方法４．２．３．２．１ 将玻璃板划成每格３ｃｍ×３ｃｍ的区域，每一格下留少许位置，用于填写样品编号。４．２．３．２．２ 上述各格标上待检样品编号，标准抗原血清型，每格加２５μＬ平板凝集抗原。４．２．３．２．３ 在各格凝集抗原旁分别加入抗血清２５μＬ。４．２．３．２．４ 用牙签或移液器枪头使抗血清与凝集抗原混匀并形成直径约２ｃｍ的液区。轻微晃动，室温下于４ｍｉｎ内观察结果。４．２．３．３ 结果判定４．２．３．３．１ 当标准ＨＳ多杀性巴氏杆菌菌体抗原对照出现凝集，标准阴性抗原不出现凝集时，则试验成立，可以判定。否则，本次试验无效。４．２．３．３．２ 在４ｍｉｎ内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性，不出现凝集者判为阴性。４犛犖／犜２７２２—２０１０４．２．４ 琼脂免疫扩散试验４．２．４．１ 材料和试剂４．２．４．１．１ 荚膜分型凝胶：见附录Ｃ。４．２．４．１．２ 菌体分型凝胶：见附录Ｃ。４．２．４．１．３ 标准ＨＳ多杀性巴氏杆菌１６型菌体分型血清。４．２．４．１．４ 标准ＨＳ多杀性巴氏杆菌Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ荚膜分型血清。４．２．４．１．５ 待检ＨＳ多杀性巴氏杆曲荚膜抗原：见附录Ｃ。４．２．４．１．６ 待检ＨＳ多杀性巴氏杆菌菌体抗原：见附录Ｃ。４．２．４．１．７ 标准菌体分型抗原和标准荚膜分型抗原。４．２．４．１．８ 标准阴性荚膜抗原和标准阴性菌体抗原。４．２．４．２ 操作方法４．２．４．２．１ 打孔在制备好的琼脂板上（分别用荚膜分型凝胶和菌体分型凝胶制作）用直径４ｍｍ的梅花形打孔器打孔。中心孔与外周孔距离为３ｍｍ。将孔中的琼脂用８号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘，避免琼脂层脱离平皿底部。４．２．４．２．２ 封底用酒精灯轻烤平皿底部到琼脂微熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。４．２．４．２．３ 加样用微量移液器分别吸取标准ＨＳ多杀性巴氏杆菌Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ荚膜分型血清或待检ＨＳ多杀性巴氏杆菌菌体抗原加入中间孔，待检ＨＳ多杀性巴氏杆菌荚膜抗原及标准荚膜分型抗原，或标准菌体分型抗血清交替加入外周孔中。加样量以孔平为准，每加一个样品应换一个吸头。４．２．４．２．４ 感作加样完毕后，静置５ｍｉｎ～１０ｍｉｎ，将平皿轻轻倒置，放入湿盒内置３７℃温箱中，分别在２４ｈ和４８ｈ观察结果。４．２．４．３ 结果判定４．２．４．３．１ 有效性判定将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与标准抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，标准阳性血清与标准阴性抗原孔之间不出沉淀线，则试验成立，可以判定。否则，本次试验无效。４．２．４．３．２ 判定标准待检抗原孔与标准分型血清孔之间出现明显的沉淀线判为阳性。４．２．５ 对流免疫电泳试验（荚膜分型）４．２．５．１ 材料准备４．２．５．１．１ 器材３ｍｍ厚５７ｍｍ×７０ｍｍ玻璃板；电压０Ｖ～３００Ｖ，电流０ｍＡ～５０ｍＡ的电泳仪；宽１００ｍｍ的５犛犖／犜２７２２—２０１０电泳槽；直径３ｍｍ的打孔器。４．２．５．１．２ 试剂巴比妥乙酸盐缓冲液和ＣＩＥＰ介质：见附录Ｃ；标准荚膜抗原、标准ＨＳ多杀性巴氏杆菌Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ分型血清、标准阴性血清和标准阴性抗原。４．２．５．１．３ 样品待检ＨＳ多杀性巴氏杆菌荚膜抗原：见附录Ｃ。４．２．５．２ 操作方法４．２．５．２．１ 铺板取３ｍｍ厚５７ｍｍ×７０ｍｍ水平无痕的玻璃板，洗净后，平放于水平桌面上，用吸管吸去１２ｍＬ已溶化并已冷却到７０℃左右的ＣＩＥＰ介质，均匀铺在玻璃板（５７ｍｍ×７０ｍｍ）上制备电泳板，在铺板时在玻璃板四周夹上档板，待冷却凝固后备用，限当日使用。４．２．５．２．２ 打孔将已凝固的电泳板置于孔径４ｍｍ、孔距７ｍｍ、排距（中心到中心）６ｍｍ，１排７孔的打孔模型图纸上打孔。４．２．５．２．３ 封底打孔完毕，将玻璃板置酒精灯外焰上加热，使各孔间ＣＩＥＰ介质与玻璃板间的间隙封住，置室温冷却３０ｍｉｎ，备用。４．２．５．２．４ 加样用微量移液器分别吸取２０μＬ待检荚膜抗原和标准荚膜分型抗原加到阴极端的孔中，同样在阳极端的孔中加等量的标准分型血清。试验对照组包括用生理盐水与标准阳性血清相对，标准荚膜抗原与标准阳性血清相对，标准阴性抗原与标准阳性血清相对。４．２．５．２．５ 电泳将电泳槽两侧加满ｐＨ８．８的巴比妥乙酸盐缓冲液（以电泳槽内的标线为准），将加样完毕的电泳板平放于电泳槽架上，血清孔置阳极，以双层滤纸或单层纱布（长度以能连接电泳板和巴比妥乙酸盐缓冲液为准），一端放在电泳板的边缘，不要盖住加样孔，一端放入电泳槽内的缓冲液中。核对电极和样品孔间正确连接后，接通电源。４．２．５．２．６ 电泳条件抗原和抗血清在１５０Ｖ（２５Ｖ／ｃｍ）电泳３０ｍｉｎ。４．２．５．３ 结果判定